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基于Phi29 DNA聚合酶的新酶挖掘及表征 被引量:1
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作者 郝梦瑶 胡玲玲 +4 位作者 韩明昊 李从雨 常宏 骆健美 江会锋 《生物工程学报》 北大核心 2025年第1期427-436,共10页
近年来,噬菌体Φ29(Phi29)DNA聚合酶因其具有恒温高保真扩增的能力,成为热点关注对象。为了进一步推进这类等温聚合酶的工业化应用,本研究将已表征的Phi29 DNA聚合酶序列针对微生物宏基因组进行新酶挖掘与表征。在植物宿主群体的宏基因... 近年来,噬菌体Φ29(Phi29)DNA聚合酶因其具有恒温高保真扩增的能力,成为热点关注对象。为了进一步推进这类等温聚合酶的工业化应用,本研究将已表征的Phi29 DNA聚合酶序列针对微生物宏基因组进行新酶挖掘与表征。在植物宿主群体的宏基因组中,鉴定出一种新酶——Php29 DNA聚合酶,该酶具有更高的链置换活性(与噬菌体Φ29的相似度达到59.5%)。实验验证结果表明,该酶也具备3ʹ→5ʹ核酸外切酶活性,其扩增产物可用于进一步的催化反应。Php29 DNA聚合酶的挖掘和验证为未来等温扩增酶的工业化应用提供了有益参考。 展开更多
关键词 新酶挖掘 phi29 DNA聚合酶 异源表达 滚环扩增 核酸外切酶活性
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噬菌体phi29末端酶gp16蛋白C端结构域在溶液中的构象分析 被引量:1
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作者 武飞飞 蔡汝洁 +2 位作者 陈婷 张云龙 陆昌瑞 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第3期305-312,共8页
噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有三个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预... 噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有三个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预测中发现gp16蛋白的C端结构域可能与pRNA或DNA结合,但尚未有相关文献可以证明这种相互作用,因此其结构的解析成为研究其功能的关键.本文利用大肠杆菌SUMO表达系统,对噬菌体phi29 gp16蛋白的C端结构域进行重组构建并诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析纯化,再用分子排阻色谱获得高纯度的目的蛋白质单体,纯度达到95%左右.最后用X射线小角散射技术(small angle X-ray scattering)对其构象进行分析,收集小角散射数据,当目的蛋白的浓度为1.3 g/L、所得到的目的蛋白的三维结构与同源蛋白FtsK的晶体结构高度拟合,且通过CRYSOL软件反推计算的曲线与实验曲线高度重合.通过原核表达、纯化及结构分析,成功获得了该结构域在溶液中的状态信息.这一研究不仅为后续关于该结构域的功能研究奠定基础,也为病毒感染的诊断和治疗提供新思路. 展开更多
关键词 噬菌体phi29 gp16蛋白 C端结构域 X射线小角散射
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Phi29DNA聚合酶最新应用研究进展 被引量:1
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作者 练杜娟 仇建萍 +2 位作者 张平静 朱远源 李谦 《药物生物技术》 CAS 2016年第2期150-154,共5页
phi29 DNA聚合酶来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29,具有连续合成和链置换性质,且具有高保真性。它是DNA扩增包括滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。文章从phi29 DNA聚合酶的来源和结构与功能、近期对于phi29 DNA聚合酶的应用研究入手,综... phi29 DNA聚合酶来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29,具有连续合成和链置换性质,且具有高保真性。它是DNA扩增包括滚环扩增和多重置换扩增的理想工具。文章从phi29 DNA聚合酶的来源和结构与功能、近期对于phi29 DNA聚合酶的应用研究入手,综述了phi29 DNA聚合酶的结构与功能的关系及其用于核酸测序,病毒检测,miRNA检测方面的应用前景。 展开更多
关键词 phi29 DNA聚合酶 滚环扩增 多重置换扩增 测序 病毒检测 miRNA检测
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基于油水界面扩散的单细胞动态调控系统构建及应用
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作者 华希锐 于文文 +5 位作者 徐显皓 武耀康 刘延峰 李江华 堵国成 吕雪芹 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第24期216-222,共7页
在液滴微流体高通量筛选中,毒性产物的合成会抑制细胞生长,导致筛选准确度下降。该研究建立了一种基于跨油相扩散诱导的动态调控系统,实现了液滴微流体中细胞生长与产物合成的解偶联。首先将单个细胞封装于液滴中进行培养,实现细胞生长... 在液滴微流体高通量筛选中,毒性产物的合成会抑制细胞生长,导致筛选准确度下降。该研究建立了一种基于跨油相扩散诱导的动态调控系统,实现了液滴微流体中细胞生长与产物合成的解偶联。首先将单个细胞封装于液滴中进行培养,实现细胞生长;然后将诱导剂IPTG封装于液滴中得到诱导液滴;再利用IPTG的油水双相亲和性实现IPTG跨越油相扩散至细胞液滴中完成诱导。以大肠杆菌(Escherichia coli)异源表达毒性蛋白Phi29 DNA聚合酶(Phi29 DNA polymerase,Phi29 Pol)为例,构建Phi29 pol-超折叠绿色荧光蛋白(super-fold green fluorescent protein, sfGFP)融合蛋白,利用sfGFP的荧光信号强度做表征;通过单因素优化确定了当诱导液滴与细胞液滴的比例为1∶100、IPTG终浓度为1.2 mmol/L时,液滴中Phi29 pol-sfGFP融合蛋白的表达水平最高,达到了单细胞的2.73倍。总的来说,该系统利用油水界面扩散实现液滴中单细胞的动态调控,有效缓解了毒性产物合成对细胞生长的抑制,为液滴微流体高通量筛选提供了方法支撑。 展开更多
关键词 液滴微流体 扩散诱导 动态调控 大肠杆菌 phi29 DNA聚合酶
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基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法研究 被引量:1
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作者 庞正 李建东 +2 位作者 李川 梁米芳 李德新 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期432-436,共5页
为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模... 为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,本研究利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA、双链cDNA、T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。结果显示,对于不同类型的RNA病毒模拟标本,多重置换扩增对于单链及双链cDNA的扩增效果有限,而双链cDNA经DNA连接酶处理后的扩增能达到6×103倍;在cDNA合成过程中加入外源辅助RNA,模拟样本中病毒基因组的扩增可达2×105倍,尤其是对含有低丰度病原体的模拟样本扩增效果的改善更为明显。本研究摸索建立了基于多重置换扩增技术的RNA病毒基因组扩增方法,能够对样本中低丰度RNA病毒基因组实现有效扩增,可满足开展多种病原体筛查检测的需求。 展开更多
关键词 多重置换扩增 phi29DNA聚合酶 RNA病毒
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多重置换扩增——一种新的全基因组扩增技术 被引量:9
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作者 刘维瑜 金春莲 《国际遗传学杂志》 CAS 2007年第4期265-268,共4页
全基因组扩增技术(MDA)用于扩增大量的DNA以满足遗传检测的需要。在高通量的遗传分型中,处理有限的临床样本的基因组DNA,一直是个瓶颈问题。一种新方法——多重置换扩增,能高度忠实的复制整个基因组DNA,扩增出10~100kb大小的片... 全基因组扩增技术(MDA)用于扩增大量的DNA以满足遗传检测的需要。在高通量的遗传分型中,处理有限的临床样本的基因组DNA,一直是个瓶颈问题。一种新方法——多重置换扩增,能高度忠实的复制整个基因组DNA,扩增出10~100kb大小的片段,能提供大量均一完整的全基因组序列。MDA是一种简单、有效的方法,非常适用于遗传研究、法医学和临床诊断的需要。 展开更多
关键词 全基因组扩增 多重置换扩增 phi29 DNA聚合酶
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一种高效扩增小片段DNA方法的建立
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作者 李岩 李珊珊 张玉祥 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2011年第1期121-124,共4页
目的建立一种高效扩增小片段DNA的方法。方法 本方法利用单链DNA连接酶(single strand DNA ligase,ssDNA ligase)可以连接单链DNA的性质将小片段DNA自连成环,随后利用phi29DNA聚合酶进行恒温的滚环复制,将扩增产物进行酶切,得到了扩增... 目的建立一种高效扩增小片段DNA的方法。方法 本方法利用单链DNA连接酶(single strand DNA ligase,ssDNA ligase)可以连接单链DNA的性质将小片段DNA自连成环,随后利用phi29DNA聚合酶进行恒温的滚环复制,将扩增产物进行酶切,得到了扩增后的小片段DNA。结果 单链DNA连接酶可以有效的将30bp的小片段DNA自连成环,phi29DNA聚合酶可以扩增出大于10kb的DNA片段,扩增产物经酶切后又可进行第二轮扩增,并且证明了其成环方式为自成环。结论 通过单链成环后滚环复制的这种方法可以有效的将小片段DNA进行扩增,解决了PCR无法扩增小片段DNA的问题,并有着广阔的应用前景。 展开更多
关键词 滚环复制 phi29DNA聚合酶 小片段DNA
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包装DNA的病毒马达被发现
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《国际医药卫生导报》 2001年第06B期30-30,共1页
关键词 phi29噬菌体 马达系统 DNA包装马达
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Photo-controlled release of paclitaxel and model drugs from RNA pyramids 被引量:5
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作者 Congcong Xu Hui Li +4 位作者 Kaiming Zhang Daniel W.Binzel Hongran Yin Wah Chiu Peixuan Guo 《Nano Research》 SCIE EI CAS CSCD 2019年第1期41-48,共8页
Stimuli-resp on sive release of drugs from a nano carrier in spatial-,temporal-,and dosage-controlled fashi ons is of great interest in the pharmaceutical industry.Paclitaxel is one of the most effective and popular c... Stimuli-resp on sive release of drugs from a nano carrier in spatial-,temporal-,and dosage-controlled fashi ons is of great interest in the pharmaceutical industry.Paclitaxel is one of the most effective and popular chemotherapeutic drugs against a number of cancers such as metastatic or non metastatic breast can cer,non-small cell lung can cer,refractory ovaria n cancer,AIDS-related Kaposi's sarcoma,and head and neck can cers.Here,by taki ng the adva ntage of RNA nanotechno logy in biomedical and material scie nee,we developed a three-dime nsional pyramid-shaped RNA nanocage for a photocontrolled release of cargo,using paclitaxel as a model drug.The light-triggered release of paclitaxel or fluorophore Cy5 was achieved by incorporation of photocleavable spacers into the RNA nanoparticles.Upon irradiation with ultraviolet light,cargos were rapidly released(within 5 min).In vitro treatment of breast can cer cells with the RNA nano particles harbori ng photocleavable paclitaxel showed higher cytotoxicity as compared to RNA nanoparticles without the photocleavable spacer.The methodology provides proof of con cept for the applicati on of the light-triggered con trolled release of drugs from RNA nano cages. 展开更多
关键词 RNA NANOTECHNOLOGY controlled release PACLITAXEL DRUG delivery RNA nanoparticles phi29 three-way JUNCTION
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Recent advances of DNA sequencing via nanopore-based technologies 被引量:2
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作者 郭秉元 曾涛 吴海臣 《Science Bulletin》 SCIE EI CAS CSCD 2015年第3期287-295,I0001,共10页
This review briefly summarizes recent progress in nanopore DNA sequencing from the beginning of 2012 to July 2014. Although partial successes have been achieved in different types of nanopores, biological pores such ... This review briefly summarizes recent progress in nanopore DNA sequencing from the beginning of 2012 to July 2014. Although partial successes have been achieved in different types of nanopores, biological pores such as α- hemolysin and MspA afford most promising results. 展开更多
关键词 DNA sequencing. Nanopore α-Hemolysin MspA phi29 connector Solid-state nanopore Graphene SWCNT
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Translation of the long-term fundamental studies on viral DNA packaging motors into nanotechnology and nanomedicine
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作者 Chenxi Liang Tao Weitao +1 位作者 Lixia Zhou Peixuan Guo 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2020年第8期1103-1129,共27页
Many years of fundamental studies on viral genome packaging motors have led to fruitful applications.The double-stranded DNA(dsDNA)viruses package their genomes into preformed protein shells via nanomotors including s... Many years of fundamental studies on viral genome packaging motors have led to fruitful applications.The double-stranded DNA(dsDNA)viruses package their genomes into preformed protein shells via nanomotors including several elegant and meticulous coaxial modules.The motor is geared by the hexameric RNA ring.An open washer displayed as hexametric string of phi29 motor ATPase has been reported.The open washer linked into a filament as a queue with left-handed chirality along the dsDNA chain.It was found that a free 5′-and 3′-dsDNA end is not required for one gp16 dimer and four monomers to assemble into the hexametric washer on dsDNA.The above studies have inspired several applications in nanotechnology and nanomedicine.These applications include:(i)studies on the precision motor channels have led to their application in the single pore sensing;(ii)investigations into the hand-in-hand integration of the hexametric pRNA ring have resulted in the emergence of the new field of RNA nanotechnology;and(iii)the studies on the motor stoichiometry of homologous multi-subunits that subsequently have inspired the discovery of new methods in highly potent drug development.This review focuses on the structure and function of the viral DNA packaging motors and describes how fundamental studies inspired various applications.Given these advantages,more nanotechnological and biomedical applications using bacteriophage motor components are expected. 展开更多
关键词 NANOPORES packaging motor phi29 pRNA single pore sensing chemical detection peptide differentiation and sensing NANOTECHNOLOGY NANOBIOTECHNOLOGY
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Current status on single molecular sequencing based on protein nanopores
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作者 Jiawei Shen Yongyong Shi 《Nano Biomedicine & Engineering》 2012年第1期1-5,共5页
In the 1960s,Hladky and Haydon have succeeded in detecting ionic flows across thin lipid membrane when adding small lipid-soluble molecules such as surface-active polypeptides to artificial membrane,which has laid the... In the 1960s,Hladky and Haydon have succeeded in detecting ionic flows across thin lipid membrane when adding small lipid-soluble molecules such as surface-active polypeptides to artificial membrane,which has laid the foundation for decoding single strand DNA when it crosses the nanopore under an applied electric field.In this paper,we will review several kinds of protein nanopores used in single molecular sequencing,such asα-hemolysin nanopore,MspA nanopore and membrane-adapted phi29 motor protein nanopore. 展开更多
关键词 Single Molecular Sequencing NANOPORE α-hemolysin MspA phi29 motor
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