pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力(英文) 被引量：3

1

作者 魏利成 刘丹平 蒲勤 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第38期7587-7590,共4页

背景:能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用?目的:观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达,同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织,利用X线观察其成骨情况... 背景:能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用?目的:观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达,同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织,利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点:观察对比实验。实验于2004-11/2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料:6只成年新西兰大白兔,雌雄不拘,体质量2.0～3.0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品,pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供,限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法:从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2,从成年兔股骨抽取骨髓,密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞,将细胞分成4组:A组:pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选;B组:pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选;C组:给予pcDNA3空载体转染;D组:仅加入脂质体转染试剂Fugene6。主要观察指标:①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达,分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中,移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果:①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100%瞬间表达BMP2。②基因转染4周后,A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后,X射线可显示新骨形成。结论:pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞,通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。 展开更多

关键词 骨髓基质细胞 pcdna3-hbmp2成骨能力 表达

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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨 被引量：5

2

作者 卜丽莎 李建军 +4 位作者 韩东 景元海 王宏 王玲 徐莘香 《中国骨伤》 CAS 2004年第8期449-451,共3页

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工... 目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP 展开更多

关键词 转染 HBMP-2 组织工程骨 体外 骨髓基质干细胞 pcdna3 骨支架 重组 构建 目的

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重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用 被引量：7

3

作者 李蕴玉 张香斋 +5 位作者 贾青辉 耿田田 张召兴 丁咚 李佩国 张艳英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期456-460,共5页

为了确定重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用,将60只14日龄雏鸡随机分成5组,分别为对照组、球虫活疫苗免疫组、球虫活疫苗免疫加50、100、150μg/只重组质粒组。分组当天进行鸡球虫病四价活疫苗免疫,1,7d分别肌肉注射重组质... 为了确定重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用,将60只14日龄雏鸡随机分成5组,分别为对照组、球虫活疫苗免疫组、球虫活疫苗免疫加50、100、150μg/只重组质粒组。分组当天进行鸡球虫病四价活疫苗免疫,1,7d分别肌肉注射重组质粒pcDNA3-IL-2。至21d时,除第1组(对照组)外,每只鸡经口灌服E.tenella卵囊8×104个。对免疫后鸡的生长性能,外周血淋巴细胞转化率,血清IFN-γ、IL-2、IgG含量以及攻虫后的抗球虫指数进行测定。结果表明,pcDNA3-IL-2重组质粒对鸡球虫疫苗免疫增效的适宜剂量为100μg/只,与第2组比较,14、21、28d的外周血淋巴细胞转化率显著提高了26.54%、27.15%和24.19%(P<0.05);血清IFN-γ含量显著提高了8.87%、14.56%和15.18%(P<0.05);血清IL-2和IgG含量分别提高了3.40%、4.09%、3.95%和12.75%、9.73%、9.87%,胸腺、法氏囊与脾脏指数分别提高了4.91%、9.27%和2.46%(P>0.05),ACI指数达180.71,提高了9.24%。 展开更多

关键词 pcdna3-IL-2重组质粒 球虫疫苗 免疫增效 抗球虫指数

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脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件 被引量：3

4

作者 韩一生 胡蕴玉 +1 位作者 金格乐 李松建 《第四军医大学学报》 北大核心 2001年第11期987-990,共4页

目的　探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法　细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进... 目的　探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法　细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果　最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论　通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 . 展开更多

关键词 软骨细胞 骨形成蛋白 基因转移 pcdna3-hbmp3 脂质体介导

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脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145 被引量：2

5

作者 宁萍 樊赛军 +3 位作者 焦旸 徐加英 胡旭东 朱巍 《海南医学院学报》 CAS 2010年第2期177-180,共4页

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺... 目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。 展开更多

关键词 脂质体 MCF-7 MDA—MB-231 ELAC2基因 pcdna3 DU-145

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人骨形态蛋白-3基因真核表达载体(PcDNA3-hBMP3)构建 被引量：3

6

作者 韩一生 惠宏襄 +1 位作者 崔大祥 胡蕴玉 《第四军医大学学报》 1999年第4期313-313,共1页

０引言人骨形态蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）可诱导多种来源的未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞转化，进而形成新骨，而且对软骨细胞也有促进分裂和增殖的作用，促进后者Ⅱ型胶原和氨基多糖（ＰＧ）的分泌．转基因技术和真核表达载体... ０引言人骨形态蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）可诱导多种来源的未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞转化，进而形成新骨，而且对软骨细胞也有促进分裂和增殖的作用，促进后者Ⅱ型胶原和氨基多糖（ＰＧ）的分泌．转基因技术和真核表达载体的产生为软骨细胞库建立和开展软骨组... 展开更多

关键词 骨形态蛋白 基因转移 pcdna3-hbmp3 构建

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pcDNA3-TIMP-2的构建与表达 被引量：1

7

作者 王长谦 王顺 +6 位作者 汤大鸣 林旭 丁弘毅 谢秀兰 徐依敏 王彬尧 黄定九 《上海第二医科大学学报》 CAS CSCD 2004年第6期413-416,420,共5页

目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2,并探讨其体外表达效果。方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP-2,酶切鉴定,并用体外培养人THP-1细胞,电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2,RT-PCR和Western blotting分... 目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2,并探讨其体外表达效果。方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP-2,酶切鉴定,并用体外培养人THP-1细胞,电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2,RT-PCR和Western blotting分别检测外源基因转染效果,Zymography检测培养上清MMPs活性。结果构建pcDNA3-TIMP-2经酶切和测序鉴定正确,电穿孔法导入体外培养人THP-1细胞后,TIMP-2 mRNA约增加2.8倍,TIMP-2蛋白表达增加约2.7倍,MMP-2和MMP-9的活性分别约为对照组的32％和28％。结论成功构建了pcDNA3-TIMP-2,且证实有良好的体外转染和表达效果,为进行转移TIMPs基因抑制MMPs及探讨其与动脉粥样硬化等多种病理过程的关系奠定基础。 展开更多

关键词 pcdna3-TIMP-2 基因表达 基因转染 基因克隆 MMPS

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pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响 被引量：1

8

作者 江青山 肖桃源 +1 位作者 邓文蓉 沈宝茗 《山东医药》 CAS 2013年第47期8-10,共3页

目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴... 目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Western blot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTT法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果 pcDNA3.1(+)-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3.1(+)-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。 展开更多

关键词 pcdna3 1(+)-血清淀粉样蛋白A CNE-2细胞 转染 增殖

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真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定 被引量：1

9

作者 先俊 邱娴 +2 位作者 张安兵 李理 黄文杰 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第21期4014-4017,共4页

目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CS... 目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达。结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达。结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础。 展开更多

关键词 CSRP2 pcdna3 1 真核表达质粒

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重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B在Hela细胞中表达的研究

10

作者 江渊 古钦民 《热带病与寄生虫学》 2004年第4期202-204,F003,共4页

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株... 目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 HELA细胞 A2/B 重组质粒 pcdna3 表达的研究 pcdna3 WESTEM 融合蛋白 免疫学活性 真核表达质粒 BLOT检测 HELA细胞 稳定转染 免疫原性 脂质体介导 P30 表达情况 细胞表达 动物实验 CTX P22 细胞株 分子量

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pcDNA3.1-CD81载体在人肝癌细胞中的表达及意义 被引量：1

11

作者 刘秋平 贾战生 《实用肝脏病杂志》 CAS 2005年第1期7-10,共4页

目的　研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法　由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ... 目的　研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法　由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ;定向克隆入真核表达载体pcDNA 3 .1(+ ) ;通过脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2 ,用免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术检测目的蛋白的表达。结果　由RT PCR及PCR方法扩增出人CD81编码基因与Genebank公布的序列完全一致。重组真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81经酶切和PCR鉴定分析正确。免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术证明转染的HepG2 细胞表面能有效地表达CD81蛋白。结论　所构建的pcDNA3 .1 CD81真核表达载体在HepG2 细胞有良好的表达 ,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供细胞模型 ,为研究丙型肝炎病毒 (HCV)与CD81相互作用奠定基础。 展开更多

关键词 CD81 人肝癌细胞 pcdna3 真核表达载体 免疫组织化学方法 HepG2细胞 流式细胞技术 T载体 MOLT-4 定向克隆

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IL-2、15、22基因对CVB3 VP1 DNA疫苗免疫效果的影响

12

作者 房文亮 牛庆茂 +2 位作者 金玉怀 揣侠 王永祥 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第3期222-224,共3页

目的观察白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、白细胞介素15(Interleukin15,IL15)和白细胞介素22(Interleukin22,IL22)基因对柯萨奇病毒(CoxasckievirusB3,CVB3)VP1DNA疫苗诱导小鼠免疫应答及保护作用的影响。方法取雄性BALBc小鼠,随机分为6... 目的观察白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、白细胞介素15(Interleukin15,IL15)和白细胞介素22(Interleukin22,IL22)基因对柯萨奇病毒(CoxasckievirusB3,CVB3)VP1DNA疫苗诱导小鼠免疫应答及保护作用的影响。方法取雄性BALBc小鼠,随机分为6组,每组20只,分别肌内注射盐水、pcDNA3、pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1、pcDNA3IL15+pcDNA3VP1和pcDNA3IL22+pcDNA3VP1,每周1次,共3次,每次免疫后6d取血清用微量中和试验检测CVB3中和抗体,3次免疫后用800TCID50CVB3感染小鼠,观察小鼠的生存时间和生存率。结果pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高。病毒攻击后,各组的生存率差异无显著意义,pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组较其他4组生存时间明显延长。pcDNA3IL22+pcDNA3VP1组虽也能诱导小鼠产生中和抗体,但抗体滴度和生存情况无明显变化。结论IL2、IL15基因对CVB3VP1DNA疫苗诱导小鼠产生免疫应答和免疫保护有一定的增强作用,而IL22基因无明显作用。 展开更多

关键词 DNA疫苗 IL-2 VP1 基因 免疫效果 pcdna3 BALB/c小鼠 白细胞介素 中和抗体 免疫应答 生存时间 抗体滴度 保护作用 试验检测 免疫次数 病毒攻击 增强作用 免疫保护 生存率 诱导 注射

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弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

13

作者 江渊 古钦民 《热带病与寄生虫学》 2004年第2期77-80,共4页

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B ... 目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 表面抗原P30 A2/B P22 弓形虫 真核表达质粒 复合基因 霍乱毒素 pcdna3 真核表达重组质粒 真核表达载体 基因片段 开放读码框 基因组DNA 哺乳动物细胞 PCR技术 PUC18 LB培养基 氨苄青霉素 克隆载体 动物实验 融合蛋白

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pcDNA_3-hBMP_2基因转染成纤维细胞及其稳定表达 被引量：4

14

作者 栗向东 胡蕴玉 +1 位作者 蒲勤 朱邦福 《中华外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期244-247,T006,共5页

目的　探讨外源性hBMP2 基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。　方法　将hBMP2 的cDNA连入真核表达载体pcDNA3 ,形成重组真核表达载体pcDNA3 hBMP2 ,在脂质体介导下 ,将其导入小鼠成纤维细胞株 (NIH3T3)。通过G418筛选获得阳性克隆 ... 目的　探讨外源性hBMP2 基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。　方法　将hBMP2 的cDNA连入真核表达载体pcDNA3 ,形成重组真核表达载体pcDNA3 hBMP2 ,在脂质体介导下 ,将其导入小鼠成纤维细胞株 (NIH3T3)。通过G418筛选获得阳性克隆 ,并继续培养 4周 ,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2 基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。　结果　经原位杂交和免疫组织化学证实 ,转染pcDNA3 hBMP2 后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。　结论　在脂质体介导下 ,hBMP2 展开更多

关键词 骨缺损 骨形态发生蛋白质烊 基因表达 成纤维细胞 基因转染 pcdna3-hbmp2 基因治疗

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HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制 被引量：3

15

作者 林纳 陈红英 +3 位作者 张生君 李丹 陈治新 王小众 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第1期19-23,F005,共6页

目的 :研究HBVX基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响。 方法 :用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3 /HBx瞬时转入HepG2细胞 ,以未转染的HepG2细胞及转染空载体 pcDNA3 的细胞为对照。RT PCR法检测HBx基因的表达 ;MT... 目的 :研究HBVX基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响。 方法 :用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3 /HBx瞬时转入HepG2细胞 ,以未转染的HepG2细胞及转染空载体 pcDNA3 的细胞为对照。RT PCR法检测HBx基因的表达 ;MTT法检测各组细胞的增殖活性 ;TUNEL法检测各组的凋亡情况。β actin为内参 ,半定量RT PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl xL、c myc的表达量变化。结果 :pcDNA3 X转染HepG2细胞后 ,RT PCR扩增出HBVX片段 ,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段。HepG2细胞转染HBx基因后 ,相对于对照组细胞增殖能力明显下降 ,凋亡增多 ,差异有显著性意义 (P <0. 0 1) ;转染HBx的细胞Bax、Bcl xL、c mycmRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高 ,差异有显著性意义 (P <0 . 0 5 )。结论 :成功将HBx基因转染入HepG2细胞 ,并在细胞中表达 ,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl xL、c mycmRNA表达 ,促进HepG2细胞凋亡 ,抑制增殖。 展开更多

关键词 HepG2细胞 基因转染 HBX基因 BCL-XL 肝癌细胞凋亡 c-myc 表达量 pcdna3 脂质体转染法 质粒

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ErbB-3结合蛋白—ebp1对ACC-M细胞生长的影响 被引量：11

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作者 余优成 张志愿 +5 位作者 陈万涛 周晓健 潘红芽 张萍 徐骎 叶冬霞 《中国临床医学》 北大核心 2005年第2期324-326,共3页

目的:探讨ErbB- 3结合蛋白—ebp1 对腺样囊性癌ACC M细胞生长增殖作用的影响。方法:通过免疫组化筛选到erbB 2/erbB -3双阳性的ACC M细胞系;转染pcDNA3.1 -ebp1 质粒至ACC M细胞,G418 筛选被转染的阳性细胞;RT- PCR检测转染后细胞中ebp... 目的:探讨ErbB- 3结合蛋白—ebp1 对腺样囊性癌ACC M细胞生长增殖作用的影响。方法:通过免疫组化筛选到erbB 2/erbB -3双阳性的ACC M细胞系;转染pcDNA3.1 -ebp1 质粒至ACC M细胞,G418 筛选被转染的阳性细胞;RT- PCR检测转染后细胞中ebp1的转录水平;细胞生长曲线及3H- TdR摄入法观察转染前后细胞生长增殖能力的改变。结果:ACC- M细胞同时表达erbB 2/erbB 3;RT -PCR显示转染后细胞中ebp1转录水平明显升高;ACC- M- ebp1 细胞生长曲线平缓,生长减慢,3H- TdR摄入量明显减少,细胞增殖能力减弱。结论:ebp1在体外能显著抑制ACC- M肿瘤细胞增殖。 展开更多

关键词 结合蛋白 ACC erbB-2 细胞生长曲线 pcdna3 生长增殖能力 细胞增殖能力 肿瘤细胞增殖 转录水平 腺样囊性癌 PCR检测 增殖作用 免疫组化 阳性细胞 M细胞 TdR ^3H 转染 细胞系 双阳性 摄入量 筛选 RT

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口服sST2质粒DNA在炎症性肠病小鼠中的免疫水平 被引量：1

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作者 朱俊丰 徐莹 +6 位作者 桑力轩 杨芳莉 李岩 尉冰 高云峰 孙逊 吕昌龙 《微生物学免疫学进展》 2016年第5期1-6,共6页

目的制备口服可溶性ST2(Soluble ST2,sST2)质粒,观察其对于小鼠炎症性结肠黏膜免疫应答水平。方法提取小鼠脾脏总RNA,扩增sST2基因,并克隆至pcDNA3.1/myc-His A载体,构建pcDNA3.1-sST2-myc-His A质粒,借此转染COS-7细胞,使之表达sST2-my... 目的制备口服可溶性ST2(Soluble ST2,sST2)质粒,观察其对于小鼠炎症性结肠黏膜免疫应答水平。方法提取小鼠脾脏总RNA,扩增sST2基因,并克隆至pcDNA3.1/myc-His A载体,构建pcDNA3.1-sST2-myc-His A质粒,借此转染COS-7细胞,使之表达sST2-myc-His A融合蛋白。利用脂质体LipofectamineTM2000包裹,制备口服sST2质粒,经灌胃给予用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱生溃疡性结肠炎的C57BL/6实验小鼠,并用组织病理学方法观察结肠黏膜组织形态变化。用Real-time PCR检测sST2基因表达,用免疫印迹检测sST2质粒融合蛋白的表达;用ELISA检测小鼠肠固有层淋巴细胞培养上清中细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的分泌水平。结果Real-time PCR检测到sST2基因的正确表达,经双酶切及测序鉴定,证明质粒pcDNA3.1-sST2-myc-His A构建成功,免疫印迹试验在转染的COS-7细胞检测到sST2-myc-His A融合蛋白的表达,其相对分子质量与预期的相符;观察到结肠黏膜组织形态发生的变化;Real-time PCR结果显示,sST2质粒组在结肠黏膜组织内sST2的表达水平明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P<0.01);ELISA结果显示sST2质粒组结肠固有层淋巴细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌水平高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P<0.05)。结论实验成功制备口服sST2质粒;该质粒可抑制小鼠炎症性结肠黏膜组织内Th2型免疫应答。 展开更多

关键词 口服 可溶性 ST2 质粒pcdna3. 1 炎症性肠病

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bcl-2基因克隆、转染及其在PC12细胞中的表达 被引量：1

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作者 吴永青 刘彦文 +1 位作者 邱鹏新 葛坚 《中山医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期99-102,共4页

【目的】研究bcl 2基因 (bcl 2 )在PC12细胞中的表达。【方法】构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组化检测外源基因表达。【结果】本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl ... 【目的】研究bcl 2基因 (bcl 2 )在PC12细胞中的表达。【方法】构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组化检测外源基因表达。【结果】本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,并用脂质体介导的方法获得了稳定表达bcl 2的细胞克隆 ;Westernblot显示有 2 6ku的蛋白质表达 ,bcl 2单克隆抗体免疫组化染色呈阳性反应。【结论】重组质粒 pcDNA3 bcl 2经转染能够在PC12细胞中有效表达 ,为进一步研究 bcl 2对PC12细胞的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 重组DNA 质粒pcdna3-bcl-2 PC12细胞 基因表达 神经退行性疾病 基因治疗 BCL-2基因 基因克隆 基因转染

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应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因 被引量：3

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作者 张黎颖 成军 +5 位作者 刘妍 郭江 黄燕萍 吴顺华 吴煜 邵清 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第3期156-158,161,共4页

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析... 目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。 展开更多

关键词 反式调节基因 抑制性消减杂交技术 丙型肝炎病毒(HCV) 筛选 CDNA消减文库 蛋白2 差异性表达基因 生物信息学分析 pcdna3 非结构蛋白 NS2蛋白 磷脂酰肌醇 核糖体蛋白 整合素β1 黄体酮受体 RaS家族 G2细胞 基因序列 蛋白基因

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干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及对膀胱癌细胞体外增殖影响

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作者 卫冰冰 徐卓群 +5 位作者 阮钧 杨树东 陈友干 诸明 周游 金柯 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期346-351,共6页

目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响。方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量... 目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响。方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量RT-PCR和Western blot检测Sox2的表达,进一步通过MTT实验初步探讨Sox2对膀胱癌细胞T24体外增殖能力的影响。结果:膀胱癌Sox2高表达率为68.6%;构建的pcDNA3.1-SOX2-EGFP转染膀胱癌细胞T24后能够成功表达;MTT实验显示,Sox2可促进膀胱癌细胞株T24体外增殖(P<0.05)。结论:Sox2在膀胱癌组织及细胞均可检测到表达,并能促进膀胱癌细胞株T24的体外增殖。 展开更多

关键词 膀胱癌 SOX2 pcdna3 1-SOX2-EGFP T24细胞

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