pcDNA3-TIMP-2的构建与表达 被引量：1

1

作者 王长谦 王顺 +6 位作者 汤大鸣 林旭 丁弘毅 谢秀兰 徐依敏 王彬尧 黄定九 《上海第二医科大学学报》 CAS CSCD 2004年第6期413-416,420,共5页

目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2,并探讨其体外表达效果。方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP-2,酶切鉴定,并用体外培养人THP-1细胞,电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2,RT-PCR和Western blotting分... 目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2,并探讨其体外表达效果。方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP-2,酶切鉴定,并用体外培养人THP-1细胞,电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2,RT-PCR和Western blotting分别检测外源基因转染效果,Zymography检测培养上清MMPs活性。结果构建pcDNA3-TIMP-2经酶切和测序鉴定正确,电穿孔法导入体外培养人THP-1细胞后,TIMP-2 mRNA约增加2.8倍,TIMP-2蛋白表达增加约2.7倍,MMP-2和MMP-9的活性分别约为对照组的32％和28％。结论成功构建了pcDNA3-TIMP-2,且证实有良好的体外转染和表达效果,为进行转移TIMPs基因抑制MMPs及探讨其与动脉粥样硬化等多种病理过程的关系奠定基础。 展开更多

关键词 pcdna3-timp-2 基因表达 基因转染 基因克隆 MMPS

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重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用 被引量：7

2

作者 李蕴玉 张香斋 +5 位作者 贾青辉 耿田田 张召兴 丁咚 李佩国 张艳英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期456-460,共5页

为了确定重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用,将60只14日龄雏鸡随机分成5组,分别为对照组、球虫活疫苗免疫组、球虫活疫苗免疫加50、100、150μg/只重组质粒组。分组当天进行鸡球虫病四价活疫苗免疫,1,7d分别肌肉注射重组质... 为了确定重组质粒pcDNA3-IL-2对鸡球虫疫苗的免疫增效作用,将60只14日龄雏鸡随机分成5组,分别为对照组、球虫活疫苗免疫组、球虫活疫苗免疫加50、100、150μg/只重组质粒组。分组当天进行鸡球虫病四价活疫苗免疫,1,7d分别肌肉注射重组质粒pcDNA3-IL-2。至21d时,除第1组(对照组)外,每只鸡经口灌服E.tenella卵囊8×104个。对免疫后鸡的生长性能,外周血淋巴细胞转化率,血清IFN-γ、IL-2、IgG含量以及攻虫后的抗球虫指数进行测定。结果表明,pcDNA3-IL-2重组质粒对鸡球虫疫苗免疫增效的适宜剂量为100μg/只,与第2组比较,14、21、28d的外周血淋巴细胞转化率显著提高了26.54%、27.15%和24.19%(P<0.05);血清IFN-γ含量显著提高了8.87%、14.56%和15.18%(P<0.05);血清IL-2和IgG含量分别提高了3.40%、4.09%、3.95%和12.75%、9.73%、9.87%,胸腺、法氏囊与脾脏指数分别提高了4.91%、9.27%和2.46%(P>0.05),ACI指数达180.71,提高了9.24%。 展开更多

关键词 pcdna3-IL-2重组质粒 球虫疫苗 免疫增效 抗球虫指数

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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨 被引量：5

3

作者 卜丽莎 李建军 +4 位作者 韩东 景元海 王宏 王玲 徐莘香 《中国骨伤》 CAS 2004年第8期449-451,共3页

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工... 目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP 展开更多

关键词 转染 HBMP-2 组织工程骨 体外 骨髓基质干细胞 pcdna3 骨支架 重组 构建 目的

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脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145 被引量：2

4

作者 宁萍 樊赛军 +3 位作者 焦旸 徐加英 胡旭东 朱巍 《海南医学院学报》 CAS 2010年第2期177-180,共4页

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺... 目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。 展开更多

关键词 脂质体 MCF-7 MDA—MB-231 ELAC2基因 pcdna3 DU-145

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pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力(英文) 被引量：3

5

作者 魏利成 刘丹平 蒲勤 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第38期7587-7590,共4页

背景:能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用?目的:观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达,同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织,利用X线观察其成骨情况... 背景:能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用?目的:观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达,同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织,利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点:观察对比实验。实验于2004-11/2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料:6只成年新西兰大白兔,雌雄不拘,体质量2.0～3.0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品,pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供,限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法:从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2,从成年兔股骨抽取骨髓,密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞,将细胞分成4组:A组:pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选;B组:pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选;C组:给予pcDNA3空载体转染;D组:仅加入脂质体转染试剂Fugene6。主要观察指标:①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达,分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中,移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果:①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100%瞬间表达BMP2。②基因转染4周后,A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后,X射线可显示新骨形成。结论:pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞,通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。 展开更多

关键词 骨髓基质细胞 pcdna3-hBMP2成骨能力 表达

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pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响 被引量：1

6

作者 江青山 肖桃源 +1 位作者 邓文蓉 沈宝茗 《山东医药》 CAS 2013年第47期8-10,共3页

目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴... 目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Western blot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTT法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果 pcDNA3.1(+)-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3.1(+)-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。 展开更多

关键词 pcdna3 1(+)-血清淀粉样蛋白A CNE-2细胞 转染 增殖

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真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定 被引量：1

7

作者 先俊 邱娴 +2 位作者 张安兵 李理 黄文杰 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第21期4014-4017,共4页

目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CS... 目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达。结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达。结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础。 展开更多

关键词 CSRP2 pcdna3 1 真核表达质粒

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重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B在Hela细胞中表达的研究

8

作者 江渊 古钦民 《热带病与寄生虫学》 2004年第4期202-204,F003,共4页

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株... 目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 HELA细胞 A2/B 重组质粒 pcdna3 表达的研究 pcdna3 WESTEM 融合蛋白 免疫学活性 真核表达质粒 BLOT检测 HELA细胞 稳定转染 免疫原性 脂质体介导 P30 表达情况 细胞表达 动物实验 CTX P22 细胞株 分子量

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pcDNA3.1-CD81载体在人肝癌细胞中的表达及意义 被引量：1

9

作者 刘秋平 贾战生 《实用肝脏病杂志》 CAS 2005年第1期7-10,共4页

目的　研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法　由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ... 目的　研究人白细胞分化抗原CD81真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81在人肝癌细胞系HepG2 中的表达及意义。方法　由人Molt 4细胞提取细胞总RNA ,根据已公布的序列设计引物 ,运用RT PCR及PCR方法扩增出人CD81基因 ,应用TA克隆插入PMD 18T载体 ;定向克隆入真核表达载体pcDNA 3 .1(+ ) ;通过脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2 ,用免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术检测目的蛋白的表达。结果　由RT PCR及PCR方法扩增出人CD81编码基因与Genebank公布的序列完全一致。重组真核表达载体pcDNA 3 .1 CD81经酶切和PCR鉴定分析正确。免疫组织化学方法 (ABC法 )及流式细胞技术证明转染的HepG2 细胞表面能有效地表达CD81蛋白。结论　所构建的pcDNA3 .1 CD81真核表达载体在HepG2 细胞有良好的表达 ,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供细胞模型 ,为研究丙型肝炎病毒 (HCV)与CD81相互作用奠定基础。 展开更多

关键词 CD81 人肝癌细胞 pcdna3 真核表达载体 免疫组织化学方法 HepG2细胞 流式细胞技术 T载体 MOLT-4 定向克隆

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IL-2、15、22基因对CVB3 VP1 DNA疫苗免疫效果的影响

10

作者 房文亮 牛庆茂 +2 位作者 金玉怀 揣侠 王永祥 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2005年第3期222-224,共3页

目的观察白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、白细胞介素15(Interleukin15,IL15)和白细胞介素22(Interleukin22,IL22)基因对柯萨奇病毒(CoxasckievirusB3,CVB3)VP1DNA疫苗诱导小鼠免疫应答及保护作用的影响。方法取雄性BALBc小鼠,随机分为6... 目的观察白细胞介素2(Interleukin2,IL2)、白细胞介素15(Interleukin15,IL15)和白细胞介素22(Interleukin22,IL22)基因对柯萨奇病毒(CoxasckievirusB3,CVB3)VP1DNA疫苗诱导小鼠免疫应答及保护作用的影响。方法取雄性BALBc小鼠,随机分为6组,每组20只,分别肌内注射盐水、pcDNA3、pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1、pcDNA3IL15+pcDNA3VP1和pcDNA3IL22+pcDNA3VP1,每周1次,共3次,每次免疫后6d取血清用微量中和试验检测CVB3中和抗体,3次免疫后用800TCID50CVB3感染小鼠,观察小鼠的生存时间和生存率。结果pcDNA3VP1、pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高。病毒攻击后,各组的生存率差异无显著意义,pcDNA3IL2+pcDNA3VP1和pcDNA3IL15+pcDNA3VP1组较其他4组生存时间明显延长。pcDNA3IL22+pcDNA3VP1组虽也能诱导小鼠产生中和抗体,但抗体滴度和生存情况无明显变化。结论IL2、IL15基因对CVB3VP1DNA疫苗诱导小鼠产生免疫应答和免疫保护有一定的增强作用,而IL22基因无明显作用。 展开更多

关键词 DNA疫苗 IL-2 VP1 基因 免疫效果 pcdna3 BALB/c小鼠 白细胞介素 中和抗体 免疫应答 生存时间 抗体滴度 保护作用 试验检测 免疫次数 病毒攻击 增强作用 免疫保护 生存率 诱导 注射

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弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

11

作者 江渊 古钦民 《热带病与寄生虫学》 2004年第2期77-80,共4页

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B ... 目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。 展开更多

关键词 表面抗原P30 A2/B P22 弓形虫 真核表达质粒 复合基因 霍乱毒素 pcdna3 真核表达重组质粒 真核表达载体 基因片段 开放读码框 基因组DNA 哺乳动物细胞 PCR技术 PUC18 LB培养基 氨苄青霉素 克隆载体 动物实验 融合蛋白

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HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制 被引量：3

12

作者 林纳 陈红英 +3 位作者 张生君 李丹 陈治新 王小众 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第1期19-23,F005,共6页

目的 :研究HBVX基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响。 方法 :用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3 /HBx瞬时转入HepG2细胞 ,以未转染的HepG2细胞及转染空载体 pcDNA3 的细胞为对照。RT PCR法检测HBx基因的表达 ;MT... 目的 :研究HBVX基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响。 方法 :用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3 /HBx瞬时转入HepG2细胞 ,以未转染的HepG2细胞及转染空载体 pcDNA3 的细胞为对照。RT PCR法检测HBx基因的表达 ;MTT法检测各组细胞的增殖活性 ;TUNEL法检测各组的凋亡情况。β actin为内参 ,半定量RT PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl xL、c myc的表达量变化。结果 :pcDNA3 X转染HepG2细胞后 ,RT PCR扩增出HBVX片段 ,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段。HepG2细胞转染HBx基因后 ,相对于对照组细胞增殖能力明显下降 ,凋亡增多 ,差异有显著性意义 (P <0. 0 1) ;转染HBx的细胞Bax、Bcl xL、c mycmRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高 ,差异有显著性意义 (P <0 . 0 5 )。结论 :成功将HBx基因转染入HepG2细胞 ,并在细胞中表达 ,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl xL、c mycmRNA表达 ,促进HepG2细胞凋亡 ,抑制增殖。 展开更多

关键词 HepG2细胞 基因转染 HBX基因 BCL-XL 肝癌细胞凋亡 c-myc 表达量 pcdna3 脂质体转染法 质粒

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ErbB-3结合蛋白—ebp1对ACC-M细胞生长的影响 被引量：11

13

作者 余优成 张志愿 +5 位作者 陈万涛 周晓健 潘红芽 张萍 徐骎 叶冬霞 《中国临床医学》 北大核心 2005年第2期324-326,共3页

目的:探讨ErbB- 3结合蛋白—ebp1 对腺样囊性癌ACC M细胞生长增殖作用的影响。方法:通过免疫组化筛选到erbB 2/erbB -3双阳性的ACC M细胞系;转染pcDNA3.1 -ebp1 质粒至ACC M细胞,G418 筛选被转染的阳性细胞;RT- PCR检测转染后细胞中ebp... 目的:探讨ErbB- 3结合蛋白—ebp1 对腺样囊性癌ACC M细胞生长增殖作用的影响。方法:通过免疫组化筛选到erbB 2/erbB -3双阳性的ACC M细胞系;转染pcDNA3.1 -ebp1 质粒至ACC M细胞,G418 筛选被转染的阳性细胞;RT- PCR检测转染后细胞中ebp1的转录水平;细胞生长曲线及3H- TdR摄入法观察转染前后细胞生长增殖能力的改变。结果:ACC- M细胞同时表达erbB 2/erbB 3;RT -PCR显示转染后细胞中ebp1转录水平明显升高;ACC- M- ebp1 细胞生长曲线平缓,生长减慢,3H- TdR摄入量明显减少,细胞增殖能力减弱。结论:ebp1在体外能显著抑制ACC- M肿瘤细胞增殖。 展开更多

关键词 结合蛋白 ACC erbB-2 细胞生长曲线 pcdna3 生长增殖能力 细胞增殖能力 肿瘤细胞增殖 转录水平 腺样囊性癌 PCR检测 增殖作用 免疫组化 阳性细胞 M细胞 TdR ^3H 转染 细胞系 双阳性 摄入量 筛选 RT

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口服sST2质粒DNA在炎症性肠病小鼠中的免疫水平 被引量：1

14

作者 朱俊丰 徐莹 +6 位作者 桑力轩 杨芳莉 李岩 尉冰 高云峰 孙逊 吕昌龙 《微生物学免疫学进展》 2016年第5期1-6,共6页

目的制备口服可溶性ST2(Soluble ST2,sST2)质粒,观察其对于小鼠炎症性结肠黏膜免疫应答水平。方法提取小鼠脾脏总RNA,扩增sST2基因,并克隆至pcDNA3.1/myc-His A载体,构建pcDNA3.1-sST2-myc-His A质粒,借此转染COS-7细胞,使之表达sST2-my... 目的制备口服可溶性ST2(Soluble ST2,sST2)质粒,观察其对于小鼠炎症性结肠黏膜免疫应答水平。方法提取小鼠脾脏总RNA,扩增sST2基因,并克隆至pcDNA3.1/myc-His A载体,构建pcDNA3.1-sST2-myc-His A质粒,借此转染COS-7细胞,使之表达sST2-myc-His A融合蛋白。利用脂质体LipofectamineTM2000包裹,制备口服sST2质粒,经灌胃给予用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)诱生溃疡性结肠炎的C57BL/6实验小鼠,并用组织病理学方法观察结肠黏膜组织形态变化。用Real-time PCR检测sST2基因表达,用免疫印迹检测sST2质粒融合蛋白的表达;用ELISA检测小鼠肠固有层淋巴细胞培养上清中细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的分泌水平。结果Real-time PCR检测到sST2基因的正确表达,经双酶切及测序鉴定,证明质粒pcDNA3.1-sST2-myc-His A构建成功,免疫印迹试验在转染的COS-7细胞检测到sST2-myc-His A融合蛋白的表达,其相对分子质量与预期的相符;观察到结肠黏膜组织形态发生的变化;Real-time PCR结果显示,sST2质粒组在结肠黏膜组织内sST2的表达水平明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P<0.01);ELISA结果显示sST2质粒组结肠固有层淋巴细胞培养上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌水平高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P<0.05)。结论实验成功制备口服sST2质粒;该质粒可抑制小鼠炎症性结肠黏膜组织内Th2型免疫应答。 展开更多

关键词 口服 可溶性 ST2 质粒pcdna3. 1 炎症性肠病

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bcl-2基因克隆、转染及其在PC12细胞中的表达 被引量：1

15

作者 吴永青 刘彦文 +1 位作者 邱鹏新 葛坚 《中山医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期99-102,共4页

【目的】研究bcl 2基因 (bcl 2 )在PC12细胞中的表达。【方法】构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组化检测外源基因表达。【结果】本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl ... 【目的】研究bcl 2基因 (bcl 2 )在PC12细胞中的表达。【方法】构建真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,采用脂质体介导将重组质粒导入PC12细胞 ,Westernblot和原位免疫组化检测外源基因表达。【结果】本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3 bcl 2 ,并用脂质体介导的方法获得了稳定表达bcl 2的细胞克隆 ;Westernblot显示有 2 6ku的蛋白质表达 ,bcl 2单克隆抗体免疫组化染色呈阳性反应。【结论】重组质粒 pcDNA3 bcl 2经转染能够在PC12细胞中有效表达 ,为进一步研究 bcl 2对PC12细胞的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 重组DNA 质粒pcdna3-bcl-2 PC12细胞 基因表达 神经退行性疾病 基因治疗 BCL-2基因 基因克隆 基因转染

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应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因 被引量：3

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作者 张黎颖 成军 +5 位作者 刘妍 郭江 黄燕萍 吴顺华 吴煜 邵清 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第3期156-158,161,共4页

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析... 目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。 展开更多

关键词 反式调节基因 抑制性消减杂交技术 丙型肝炎病毒(HCV) 筛选 CDNA消减文库 蛋白2 差异性表达基因 生物信息学分析 pcdna3 非结构蛋白 NS2蛋白 磷脂酰肌醇 核糖体蛋白 整合素β1 黄体酮受体 RaS家族 G2细胞 基因序列 蛋白基因

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干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及对膀胱癌细胞体外增殖影响

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作者 卫冰冰 徐卓群 +5 位作者 阮钧 杨树东 陈友干 诸明 周游 金柯 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期346-351,共6页

目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响。方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量... 目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响。方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量RT-PCR和Western blot检测Sox2的表达,进一步通过MTT实验初步探讨Sox2对膀胱癌细胞T24体外增殖能力的影响。结果:膀胱癌Sox2高表达率为68.6%;构建的pcDNA3.1-SOX2-EGFP转染膀胱癌细胞T24后能够成功表达;MTT实验显示,Sox2可促进膀胱癌细胞株T24体外增殖(P<0.05)。结论:Sox2在膀胱癌组织及细胞均可检测到表达,并能促进膀胱癌细胞株T24的体外增殖。 展开更多

关键词 膀胱癌 SOX2 pcdna3 1-SOX2-EGFP T24细胞

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Darier病ATP2A2基因A68E突变的定点诱变及其突变载体构建

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作者 史丙俊 江阳 +3 位作者 薛梅 刁庆春 胡刚 冯捷 《中国皮肤性病学杂志》 CAS 北大核心 2013年第1期29-32,共4页

目的利用大引物PCR技术对发现的中国人Darier病ATP2A2基因A68E突变进行体外定点诱变,并构建携带有突变基因的真核表达载体。方法首先设计三条引物(包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物),通过2轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点... 目的利用大引物PCR技术对发现的中国人Darier病ATP2A2基因A68E突变进行体外定点诱变,并构建携带有突变基因的真核表达载体。方法首先设计三条引物(包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物),通过2轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点的片段(ATP2A2-A68E),然后将突变片段克隆入pGEM-T载体中,通过双酶切后进行连接,将目的片段重组至真核表达载体pcDNA3.1中。结果用大引物PCR法成功构建ATP2A2基因A68E突变片段,测序结果显示了ATP2A2基因上203位碱基C已变为A,此突变导致ATP2A2基因第68位密码子由丙氨酸变为谷氨酸。结论 pcDNA3.1-ATP2A2-A68E突变体的成功构建,为进一步进行该突变体的结构与功能的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 大引物PCR ATP2A2 毛囊角化病 定点诱变 pcdna3 1

原文传递

鼠白细胞介素2真核表达质粒的构建及鉴定

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作者 张富春 马正海 +2 位作者 马纪 郭江勇 钟哲 《新疆大学学报（理工版）》 CAS 2001年第3期280-283,共4页

利用小鼠 IL- 2基因构建真核表达质粒 ,筛选的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序 ,结果表明小鼠 IL- 2基因被正确地克隆到 p CDNA3 真核表达质粒上 ;将真核表达质粒 p CD-NA3 IL - 2 ,转化大肠杆菌细胞 ,增菌培养后大量提取 p C... 利用小鼠 IL- 2基因构建真核表达质粒 ,筛选的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序 ,结果表明小鼠 IL- 2基因被正确地克隆到 p CDNA3 真核表达质粒上 ;将真核表达质粒 p CD-NA3 IL - 2 ,转化大肠杆菌细胞 ,增菌培养后大量提取 p CDNA3 IL - 2质粒 ,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度 ,为加强控制鼠害 展开更多

关键词 pcdna3IL-2 白细胞介素2 真核心表达质粒 基因测序 T细胞生长因子 免疫功能

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乙型肝炎病毒S与GM—CSF融合基因在HepG2细胞中的表达

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作者 郭晓兰 唐恩洁 邓健康 《世界感染杂志》 2005年第1期34-37,共4页

目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎DNA疫苗的免疫增强作用。方法采用PCR方法，扩增乙型肝炎S基因约680bp的片段和GM—CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过基因定向克隆技术，构建融合基因真核表达质粒pcDNA... 目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)对乙型肝炎DNA疫苗的免疫增强作用。方法采用PCR方法，扩增乙型肝炎S基因约680bp的片段和GM—CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过基因定向克隆技术，构建融合基因真核表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒pcDNA3．1-S-GM-CSF成功构建。将其转染HepG2细胞后，RT-PCR检测目的基因的转录，表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-GM-CSF单克隆抗体(mAbs)均产生特异性反应。结论融合基因表达载体pcDNA3．1-s-GM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙型肝炎融合基因疫苗奠定了一定实验基础。 展开更多

关键词 融合基因 GM—CSF GM-CSF HEPG2细胞 表达载体 乙型肝炎 pcdna3 目的基因 定向克隆 转录

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