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食品级重组乳酸乳球菌强组成型分泌猪肠道益生的pEGF-p40
1
作者 何容肖 吴杨博 +10 位作者 张淑霞 赵锃珏 黄娟 潘伟雄 任芷欣 黄浩滨 吴佳辉 吴海阳 沈世彦 孙崇军 张玲华 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2243-2258,共16页
猪表皮生长因子(pEGF)与三叶因子协同给药已被证明能有效促进猪的肠道增殖与修复。本研究旨在构建食品级重组乳酸乳球菌强组成型表达系统并将其用于融合表达pEGF以及对猪肠道有益生作用的鼠李糖乳杆菌衍生蛋白p40,以克服目前乳酸乳球菌... 猪表皮生长因子(pEGF)与三叶因子协同给药已被证明能有效促进猪的肠道增殖与修复。本研究旨在构建食品级重组乳酸乳球菌强组成型表达系统并将其用于融合表达pEGF以及对猪肠道有益生作用的鼠李糖乳杆菌衍生蛋白p40,以克服目前乳酸乳球菌重组表达中组成型表达量低的现状以及避免抗生素使用的问题,并初步探索一种更强效的猪肠道益生制剂。首先,通过金黄色葡萄球菌核酸酶报告系统,以常用乳酸乳球菌组成型启动子P32为对照,从乳酸乳球菌NZ9000组成型高表达蛋白质的启动子以及前人研究发现的乳酸乳球菌强组成型启动子中,可视化地筛选出乳酸乳球菌NZ9000的伸长因子Tu的启动子(P1)活性最强。进一步地,将pNZ8148的氯霉素抗性基因替换为乳链菌肽抗性基因,成功构建了具有良好的乳链菌肽耐受性且完全失去氯霉素抗性的食品级重组乳酸乳球菌强组成型表达系统NZ9000/pP1NR。同时,本研究利用该系统成功表达pEGF和融合蛋白pEGF-p40。细胞增殖试验结果显示,含有pEGF-p40的菌株培养上清更有效地促进猪小肠上皮细胞IPEC-J2的增殖。通过qRT-PCR检测了刺激后IPEC-J2细胞的SGLT-1、GLUT-2、SUC、EGFR和GLP2R,结果显示含有pEGF-p40的培养上清调节相关基因的表达情况不同于仅含有pEGF的培养上清。本研究构建了食品级重组乳酸乳球菌强组成型表达系统,成功表达了对猪肠道具有益生作用的pEGF-p40,为其他益生物质的安全生产提供借鉴,为开发一种强效的猪肠道益生制剂做了先行探究。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 组成型表达 pegf P40 肠道健康
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芽孢表面展示pEGF重组枯草杆菌对小鼠生长、肠道发育和消化酶活性研究
2
作者 费丽茹 陈彬 +5 位作者 胡正茂 洋赐 张丹 但鑫瑶 吴乐鹏 潘康成 《四川农业大学学报》 北大核心 2025年第2期469-478,共10页
【目的】构建一株在芽孢表面展示猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌,并评估其在小鼠体内的生物活性。【方法】设计得到肠激酶识别位点和pEGF串联基因序列(dkEGF),以CotB作为锚定原件构建了整合质粒pDG364-CotB-dkEGF。通过同源重... 【目的】构建一株在芽孢表面展示猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌,并评估其在小鼠体内的生物活性。【方法】设计得到肠激酶识别位点和pEGF串联基因序列(dkEGF),以CotB作为锚定原件构建了整合质粒pDG364-CotB-dkEGF。通过同源重组,获得1株在芽孢表面展示pEGF的重组枯草芽孢杆菌dkEGF,评估其对小鼠生长、肠道发育及肠道消化酶活性的影响。【结果】通过拌料饲喂重组枯草杆菌的芽孢,能够在小鼠血清内检测到高水平的pEGF;提高小鼠的生长性能,增加肠道长度;极显著增加肠绒毛高度、降低隐窝深度和提高绒隐比(P<0.01),显著提高回肠组织紧密连接蛋白mRNA相对表达量(P<0.05);显著提高肠道消化酶活性(P<0.05)。【结论】成功构建的重组枯草芽孢杆菌dkEGF可促进小鼠生长、肠道发育,提高消化酶活性和维护肠道黏膜屏障方面发挥着有效作用。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 芽孢表面展示 猪表皮生长因子 生长性能 肠道健康 小鼠
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猪表皮生长因子在植物乳杆菌中的表达及其活性检测 被引量：9
3
作者 钟泽民 赖强 +2 位作者 余希尧 刘德辉 黄毓茂 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1325-1334,共10页
为获得一株高效表达猪表皮生长因子(p EGF)的重组植物乳杆菌,并检测其生物活性,从仔猪肠道内容物中分离植物乳杆菌,选择其中生物活性最强的一株(Lp-1)为宿主。以商品化乳杆菌表达载体p IAβ8为骨架,干酪乳杆菌超强组成型启动子SCP、M6... 为获得一株高效表达猪表皮生长因子(p EGF)的重组植物乳杆菌,并检测其生物活性,从仔猪肠道内容物中分离植物乳杆菌,选择其中生物活性最强的一株(Lp-1)为宿主。以商品化乳杆菌表达载体p IAβ8为骨架,干酪乳杆菌超强组成型启动子SCP、M6前体蛋白信号肽SP、猪表皮生长因子p EGF等为元件,构建表达p EGF的植物乳杆菌重组表达载体p SCPSE。用电转化方法 (2.0 k V,2 000?,25μF,4.0 ms)将重组载体p SCPSE转化入宿主菌Lp-1中获得重组植物乳杆菌Lp-p SCPSE。以Tricine-SDS-PAGE法和p EGF ELISA特异性检测试剂盒检测目的蛋白的表达;用培养12 h的阳性转化子菌体给刚断奶的BALB/c小鼠灌胃,2次/d,连续10 d,以断奶小鼠的体重、肠绒毛长度和隐窝深度的变化为指标,检测目的蛋白的生物活性。Tricine-SDS-PAGE检测和小鼠实验结果显示,重组植物乳杆菌的培养上清中出现6 k Da左右p EGF的特异性条带,且表达p EGF的重组植物乳杆菌能显著增加(P<0.05)断奶小鼠的体重、肠绒毛高度和肠隐窝深度。结果表明,p EGF在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪源乳酸杆菌 猪表皮生长因子(pegf) 断奶小鼠 绒毛高度 隐窝深度
原文传递
猪表皮生长因子在乳酸乳球菌中的表达及其生物活性研究
4
作者 周鑫鑫 郭莹莹 +4 位作者 肖运才 王金硕 周祖涛 刘华珍 石德时 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2823-2836,共14页
【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转... 【目的】构建表达猪表皮生长因子(pEGF)的乳酸乳球菌原核表达系统,并探究其对断奶仔猪腹泻的影响。【方法】以pUC57-SP45-LEISSTCDA-pEGF序列为模板,利用PCR扩增获得缺失LEISSTCDA片段的融合产物,将其与酶切pNZ8149表达载体连接后电转至乳酸乳球菌NZ3900,以LacF为筛选标记获得重组菌pEGF-NZ。用nisin诱导重组菌pEGF-NZ表达重组蛋白pEGF,并通过Tricine-SDS-PAGE检测其表达情况。改良实验室及工业发酵条件以提高pEGF表达量。利用猪回肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖试验体外验证表达的pEGF生物活性。通过动物试验验证重组蛋白pEGF对小鼠及断奶仔猪腹泻的影响。【结果】试验成功构建重组菌pEGF-NZ,并分泌表达pEGF蛋白。体外试验结果显示,pEGF蛋白能促进细胞增殖。pEGF-NZ重组菌及其表达的pEGF蛋白能延缓小鼠腹泻发生时间,降低腹泻率,保护小鼠肠绒毛的完整性。与对照组相比,pEGF-NZ重组菌处理后,小鼠结肠中乳酸菌数显著增加(P<0.05),大肠杆菌数、肠球菌数显著降低(P<0.05),白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-1β含量显著降低(P<0.05),IL-13含量显著升高(P<0.05)。饲粮中添加pEGF-NZ重组菌后,断奶仔猪腹泻情况明显缓解,平均日增重有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。【结论】pEGF-NZ重组菌及其分泌表达的pEGF能够修复肠道屏障,抑制病原菌黏附,调控肠道菌群,其主要通过下调部分促炎因子、上调抑炎因子表达发挥抑炎效果,从而保护断奶仔猪肠道健康,有效缓解腹泻。 展开更多
关键词 乳酸乳球菌 pegf-NZ重组菌 猪表皮生长因子(pegf)
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枯草芽孢杆菌表达载体的构建及猪源表皮生长因子的表达 被引量：3
5
作者 董兵 肖童 +4 位作者 李志辉 李聪 季明月 陈海清 檀建新 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期71-76,共6页
本文首先以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)穿梭载体pDG150为基础,构建了含有5个克隆位点的表达载体pTD160,并在此基础上构建了带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体pTD161和可用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG融合表达的表面展示载体pTD162。将脂肪酶基... 本文首先以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)穿梭载体pDG150为基础,构建了含有5个克隆位点的表达载体pTD160,并在此基础上构建了带有淀粉酶信号肽的分泌表达载体pTD161和可用于外源蛋白与胞衣蛋白cotG融合表达的表面展示载体pTD162。将脂肪酶基因lipa分别插入pTD161和pTD162,在B.subtilis 168中表达,其LipA酶活性分别为23.4U/mg和15.3U/mg,表明pTD载体具有良好的表达性能。通过无抗生素压力传代培养10代后,发现其稳定性仍为96.5%和95.0%,证明pTD载体具备较高的稳定性。将密码子优化后的猪源表皮生长因子基因pegf分别导入pTD161和pTD162,转化B.subtilis 168获得工程菌Bs168-pTD161-pegf和Bs168-pTD162-pegf,ELISA法证明pEGF在工程菌中表达量分别达到365ng/mL和285ng/mL,证明pEGF获得高效表达和展示。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 穿梭表达载体 表面展示载体 pegf lipaseA
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猪表皮生长因子间接竞争ELISA检测方法的建立 被引量：2
6
作者 张万江 王秀梅 杨桂香 《动物医学进展》 CSCD 2008年第3期25-28,共4页
为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原... 为建立酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测猪血清或尿液中猪表皮生长因子(porcinee pidermal growth factor,pEGF)的含量,以pEGF为包被原,人表皮生长因子(hu-mane pidermal growth factor,hEGF)为竞争抗原,两者与一定量的抗pEGF多抗反应。结果表明,理想的包被抗原浓度为0.625μg/mL,抗pEGF工作浓度为1∶64000,酶标二抗工作浓度为1∶20000,可检测的最适范围为0.4ng/mL^32ng/mL,最低检测限为1ng/mL,批内和批间变异系数分别为3.50%和5.22%。得到回归方程y=-34.53x+76.06(R2=0.993)和标准曲线,从而建立了快速定量测定pEGF含量的酶联免疫吸附试验方法。 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 多克隆抗体 间接竞争ELISA
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猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达 被引量：3
7
作者 贺超 邓璐 +1 位作者 汤承 岳华 《西南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2015年第2期144-149,共6页
根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在3... 根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据. 展开更多
关键词 猪表皮生长因子 亚克隆 诱导表达
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