期刊文献+
任意字段
题名或关键词
题名
关键词
文摘
作者
第一作者
机构
刊名
分类号
参考文献
作者简介
基金资助
栏目信息
共找到10篇文章
< 1 >
每页显示 20 50 100
已选择0条
导出题录 引用分析
参考文献
引证文献
 统计分析
检索结果
已选文献
显示方式：
猪MSTN、pAPN和CD163基因同步编辑的胚胎制备
1
作者 谢浩 陈指龙 +6 位作者 彭翠婷 潘颖婷 齐霖 赵玉兰 闭英连 宋子仪 唐中林 《中国农业科技导报(中英文)》 北大核心 2025年第11期226-239,共14页
CRISPR/Cas9作为一款强大的基因编辑工具,在猪的遗传改良中已经广泛应用。然而,单一基因的编辑无法满足多性状的同步改良。为利用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建MSTN、pAPN和CD163多基因编辑猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblas... CRISPR/Cas9作为一款强大的基因编辑工具,在猪的遗传改良中已经广泛应用。然而,单一基因的编辑无法满足多性状的同步改良。为利用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建MSTN、pAPN和CD163多基因编辑猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)并制备胚胎,首先,根据猪CD163、MSTN和pAPN蛋白功能结构域,选定MSTN外显子1、CD163外显子7及pAPN外显子2作为打靶区域,各设计2对sgRNAs,连接至骨架pX330载体,通过电转染至PEF,筛选每个基因编辑效率较高的sgRNA;然后,利用同源重组法将CD163、MSTN、pAPN单个基因的sgRNA表达盒组装成一体化串联表达系统,转化至Fast-T1感受态细胞并进行Sanger测序鉴定;最后,利用电转染方式将3基因敲除载体转染至PEF,用2.5μg·mL^(-1)的嘌呤霉素进行药筛,挑选单克隆细胞,PCR扩增后进行Sanger测序,鉴定单克隆细胞MSTN、CD163、pAPN基因的打靶序列。结果显示,CD163、MSTN、pAPN基因的sgRNA1编辑效率高于sgRNA2,因此选择较高效率sgRNA1用于构建一体化质粒。质粒测序显示,3个基因的sgRNA表达盒成功连接到骨架pX330载体上。挑取45株转染3基因编辑质粒的单克隆细胞,测序结果显示,MSTN、pAPN、CD163基因的突变率分别为62%、26%、11%,其中有4株细胞实现了3个基因同时编辑(效率为8.9%)。进一步用编辑细胞进行体细胞核移植生产胚胎,与未编辑细胞生产的胚胎在体细胞融合率、胚胎卵裂率和囊胚率上均无显著差异;测序结果显示,胚胎水平的打靶结果与体细胞一致。综上,利用CRISPR/Cas9技术制备猪MSTN、pAPN、CD163基因同时编辑的PEF和胚胎,为多基因编辑克隆猪的制备奠定基础和提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 MSTN papn CD163 多基因编辑 PEF 胚胎
在线阅读 下载PDF
慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用 被引量：2
2
作者 陆倩倩 王广操 +2 位作者 许长萌 王志建 王先炜 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期419-426,共8页
将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经... 将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。 展开更多
关键词 papn 细胞系 慢病毒载体 PEDV SC-MS株
原文传递
pEGFP-N1-pAPN-SPC段基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 被引量：1
3
作者 杨震 左玉柱 +1 位作者 裴丽华 范京惠 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第4期15-18,共4页
为了构建能够表达猪pAPN-SPC段的真核细胞表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,并在Vero细胞中进行表达,本试验从猪肠道黏膜组织基因组中扩增出pAPN-SPC段基因,插到带有EGFP基因的真核细胞表达载体pEGFP-N1中,经Bam HⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定正确后转... 为了构建能够表达猪pAPN-SPC段的真核细胞表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,并在Vero细胞中进行表达,本试验从猪肠道黏膜组织基因组中扩增出pAPN-SPC段基因,插到带有EGFP基因的真核细胞表达载体pEGFP-N1中,经Bam HⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定正确后转染Vero细胞,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达,用RT-PCR和Western blot检测pAPN-SPC段基因的表达情况。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,且pAPN-SPC段在Vero细胞中得到了有效表达,为研究pAPN-SPC段蛋白对病毒增殖效果的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 猪氨基肽酶 真核表达 猪流行性腹泻病毒 Vero细胞系
在线阅读 下载PDF
pAPN和NEU3的敲除对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的影响
4
作者 李兆龙 丰志华 +3 位作者 张冰晨 方舟 梁旺旺 陈文志 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1942-1948,1981,共8页
氨基肽酶(pAPN)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的主要受体,为了验证pAPN和唾液酸神经氨酸酶(NEU3)双基因对TGEV入侵机制的影响,应用CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除ST细胞的2个基因pAPN和NEU3。经过病毒感染试验,测定敲除2个目标基因pAPN... 氨基肽酶(pAPN)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的主要受体,为了验证pAPN和唾液酸神经氨酸酶(NEU3)双基因对TGEV入侵机制的影响,应用CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除ST细胞的2个基因pAPN和NEU3。经过病毒感染试验,测定敲除2个目标基因pAPN和NEU3的ST细胞,对病毒的侵染变化以及病毒拷贝数的变化和细胞病变改善,同时监测病毒侵染后纤连蛋白的变化。结果表明,与对照组相比,敲除2个目标基因pAPN和NEU3的ST细胞,明显减轻TGEV侵染引起的细胞病变,TGEV的拷贝数也明显出现下降。此外,同样滴度的TGEV侵染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞后,诱导ST细胞的免疫应答物IFN-β的mRNA水平明显低于野生型ST细胞组。pAPN和NEU3双基因的敲除,明显降低了ST细胞中TGEV的拷贝数,同时也减轻病毒引起的细胞病变,结果证实细胞中的pAPN和NEU3双基因可作为将来养猪生产中抗病毒治疗及抗病品种选育的靶基因。 展开更多
关键词 氨基肽酶 唾液酸神经氨酸酶 猪传染性胃肠炎病毒 病毒的拷贝数
原文传递
猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析 被引量：5
5
作者 王衡 刘博奇 +1 位作者 任晓峰 宁章勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期821-825,共5页
为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对... 为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。 展开更多
关键词 猪氨肽酶N(papn) 多抗血清 活性检测
原文传递
猪氨基肽酶在昆虫细胞的分段表达及鉴定 被引量：3
6
作者 单智夫 唐丽杰 +2 位作者 乔薪媛 葛俊伟 李一经 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期12-16,共5页
为研究猪的氨基肽酶(Porcine aminopeptidase,pAPN)的特异性功能区域及作用机制,将除去信号肽的pAPN分为SPA,SPB和SPC三段,利用一对同尾酶XholI和SalI将信号肽分别与SPA,SPB和SPC相连接后再构建到杆状病毒表达载体pFastBacTM1上,通过杆... 为研究猪的氨基肽酶(Porcine aminopeptidase,pAPN)的特异性功能区域及作用机制,将除去信号肽的pAPN分为SPA,SPB和SPC三段,利用一对同尾酶XholI和SalI将信号肽分别与SPA,SPB和SPC相连接后再构建到杆状病毒表达载体pFastBacTM1上,通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系进行蛋白表达。结果表明,经SDS-PAGE分析可见获得的目的蛋白与预期大小相一致,即SPA约为42 ku,SPB和SPC相同,约为56 ku的分泌蛋白;经western-blot鉴定三段蛋白均可与天然的pAPN抗血清特异性结合,表明已经成功获得SPA,SPB和SPC三段蛋白,可为进一步研究pAPN特异性功能区域奠定基础。 展开更多
关键词 papn分段 杆状病毒-昆虫细胞表达体系 表达与鉴定
在线阅读 下载PDF
隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达 被引量：2
7
作者 袁婷婷 秦毅斌 +7 位作者 王若木 刘芳 陈樱 韦祖樟 何颖 黄伟坚 赵武 欧阳康 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第6期1648-1658,共11页
本研究旨在进行猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将p... 本研究旨在进行猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2949 bp,开放性阅读框为2892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列(登录号:NM_214277)相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。 展开更多
关键词 papn基因 原核表达 变异位点
在线阅读 下载PDF
猪氨基肽酶对PEDV感染作用的研究进展 被引量：5
8
作者 李公美 幺乃全 +6 位作者 李茂辉 孙武文 高云航 胡静涛 徐凤宇 单春兰 马红霞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期1421-1427,共7页
近些年,猪流行性腹泻病毒(PEDV)的变异及分离一直是业界研究的热点,而猪氨基肽酶(pAPN)是否为PEDV感染的功能性受体一直备受争议。因此,论文就pAPN对PEDV作为受体及在PEDV感染中的作用的最新研究进展进行综述,以期阐明pAPN是否为PEDV的... 近些年,猪流行性腹泻病毒(PEDV)的变异及分离一直是业界研究的热点,而猪氨基肽酶(pAPN)是否为PEDV感染的功能性受体一直备受争议。因此,论文就pAPN对PEDV作为受体及在PEDV感染中的作用的最新研究进展进行综述,以期阐明pAPN是否为PEDV的功能性受体并为PEDV的分离及后续研究提供参考。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪氨基肽酶 功能性受体 分离
原文传递
氨肽酶N鼠源单链抗体T7噬菌体展示文库的构建
9
作者 Sun D 刘丹 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第10期222-222,共1页
氨肽酶N(pAPN)是一种常见的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的细胞受体。为研究抗pAPN的单链抗体(scFv),试验设计一系列简并引物,通过RT-PCR方法从免疫了天然pAPN的BALB/c小鼠脾中克隆了免疫球蛋白轻链可变区(VL)和... 氨肽酶N(pAPN)是一种常见的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的细胞受体。为研究抗pAPN的单链抗体(scFv),试验设计一系列简并引物,通过RT-PCR方法从免疫了天然pAPN的BALB/c小鼠脾中克隆了免疫球蛋白轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的编码基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)用12个氨基酸的连接肽将VL和VH的扩增产物随机连接,从而获得单链抗体基因。将整个单链抗体基因与T7Select10-3b载体连接,通过体外包装获得了针对pAPN的鼠源ScFv噬菌体文库。pAPN单链抗体初级文库包含2.0×107个重组噬菌体克隆,扩增后的文库滴度达到3.6×109 PFU/mL。Bst NⅠ酶切分析和DNA测序结果显示,28个pAPN抗体初级文库的噬菌体克隆多样性良好。以pAPN C亚基重组蛋白为包被抗原,用噬菌体ELISA进一步验证抗pAPN单链抗体库的活性。本研究主要介绍了采用T7噬菌体展示系统构建猪冠状病毒TGEV和PEDV通用受体pAPN的鼠源单链抗体库及其鉴定。 展开更多
关键词 papn 抗体 噬菌体抗体库 TGEV PEDV
在线阅读 下载PDF
猪氨基肽酶N不是猪德尔塔冠状病毒入侵宿主细胞的受体 被引量：8
10
作者 卢曼曼 张家林 +7 位作者 王洪峰 时洪艳 张鑫 袁婧 石达 刘建波 陈建飞 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期701-706,共6页
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新出现的冠状病毒,能够引起猪只发生呕吐和水样腹泻,临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)相似。相关研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PED病毒(PEDV)和TGE病毒(TGEV)入侵宿主细胞的功能性受体。为研究pAPN是否是PDCoV入侵宿主细胞的受体,本研究以TGEV为指示病毒,通过BHK-pAPN细胞感染试验、pAPNRNA干扰试验、ST细胞过表达pAPN试验、可溶性pAPN阻断试验,发现BHK-pAPN细胞是PDCoV非易感细胞,在易感细胞ST上沉默和过表达pAPN对PDCoV的增殖并无影响,可溶性pAPN不能阻止PDCoV感染ST细胞。这些研究结果表明pAPN不是PDCoV入侵宿主细胞的受体,而且对PDCoV的增殖无影响。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 猪氨基肽酶N 受体
在线阅读 下载PDF
已选择0条
导出题录 引用分析
参考文献
引证文献
 统计分析
检索结果
已选文献
上一页 1 下一页 到第 页
使用帮助 返回顶部