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牦牛源大肠杆菌OmpA外膜蛋白的原核表达及免疫效果评价 被引量：1
1
作者 章石楠 韩生义 +6 位作者 石田 李淑萍 胡国元 高瑞 田嘉琪 周雯雯 李生庆 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第3期458-465,472,共9页
用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析,并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级... 用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析,并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测;将OmpA基因片段与pET-32a载体连接,构建原核表达载体,在BL21(DE3)进行原核表达并优化表达条件后用镍柱亲和纯化系统进行纯化;将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀后免疫小鼠,利用ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平及小鼠血清中细胞因子CD4、CD8、IL-4的表达水平,并通过小鼠攻毒保护试验评价其免疫保护效果。结果显示,OmpA蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构域,二级结构主要由无规则卷曲(47.98%)和α-螺旋(29.77%)构成,有12个能与B细胞产生的抗体结合的抗原表位。经原核表达成功获得相对分子质量约为55 kDa的重组蛋白OmpA,且在37℃、IPTG浓度0.0004 mol/L诱导6 h的表达量最高。重组蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶32000;与对照组相比,免疫小鼠血清中CD4、CD8及IL-4的表达水平均有升高。用最小致死量(minimum lethal dose,MLD)、2倍最小致死量(2MLD)攻毒后小鼠存活率分别为80%、40%。结果表明,OmpA重组蛋白具有良好的抗原性和一定的免疫保护作用。该研究为下一步基于OmpA蛋白的牦牛适用性E.coli基因工程亚单位疫苗的研制提供了技术依据。 展开更多
关键词 牦牛源大肠杆菌 ompa蛋白 原核表达 生物信息学分析 免疫保护效果
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牛多杀性巴氏杆菌OmpA抗原间接ELISA方法的建立 被引量：1
2
作者 王润清 孙航 +4 位作者 孙雨 李歌 李琦 侯晓林 阚威 《中国动物检疫》 2025年第2期87-94,共8页
为建立一种快速检测牛多杀性巴氏杆菌的方法,分析多杀性巴氏杆菌OmpA序列信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pET32a载体上,构建相应的重组质粒pET32a-OmpA;将重组质粒转化... 为建立一种快速检测牛多杀性巴氏杆菌的方法,分析多杀性巴氏杆菌OmpA序列信号肽与跨膜疏水区序列,对选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成后的核苷酸序列连接至pET32a载体上,构建相应的重组质粒pET32a-OmpA;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞株中,经扩大培养成功诱导表达出了纯度较高的包涵体OmpA蛋白,将OmpA重组蛋白作为诊断抗原,经反应条件优化建立了间接ELISA抗体检测方法。经试验验证,该方法对其他相关的牛类病原无交叉反应,阳性血清稀释度为1:256时仍呈阳性,组内与组间变异系数均低于10%。结果表明,该方法特异性与敏感性较好,且具有良好的重复性与稳定性。本研究为进一步开发成熟的牛多杀性巴氏杆菌抗体检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 牛多杀性巴氏杆菌 ompa蛋白 原核表达 蛋白纯化 ELISA
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
3
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA
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致羔羊脑膜炎型大肠杆菌ompA基因缺失菌株的构建及其致病性
4
作者 胡卉琪 崔续媛 +4 位作者 闫乃天 郑学博 张福慧 胡俊英 王新平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2123-2129,共7页
应用CRISPR/Cas9技术构建NMGCF-19ΔompA菌株,并应用小鼠模型确定ompA基因在NMGCF-19菌株感染小鼠中的作用及其机制。结果显示,与野生型菌株比较,ompA基因敲除菌株感染小鼠的海马体神经元细胞坏死明显降低,且不呈局灶性;同时,脑组织中... 应用CRISPR/Cas9技术构建NMGCF-19ΔompA菌株,并应用小鼠模型确定ompA基因在NMGCF-19菌株感染小鼠中的作用及其机制。结果显示,与野生型菌株比较,ompA基因敲除菌株感染小鼠的海马体神经元细胞坏死明显降低,且不呈局灶性;同时,脑组织中菌体检出量明显减少,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的mRNA水平和蛋白表达水平均明显提高。结果表明,ompA基因敲除后NMGCF-19菌株其致病性降低,该毒力基因ompA在NMGCF-19侵袭小鼠血脑屏障的过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 ompa基因 大肠杆菌NMGCF-19 脑膜炎 基因敲除 小鼠
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新城疫病毒F蛋白和禽致病性大肠杆菌OmpA嵌合蛋白的表达及双特异性抗体制备
5
作者 袁橙 王永娟 +2 位作者 郭梦娇 刘思琪 周雨豪 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第1期103-108,共6页
为获得Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)融合蛋白(fusion protein,F蛋白)和O18型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜基因A(outer-membrane proteases,OmpA)嵌合蛋白和双特异性抗体,试验首先采... 为获得Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)融合蛋白(fusion protein,F蛋白)和O18型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜基因A(outer-membrane proteases,OmpA)嵌合蛋白和双特异性抗体,试验首先采用基因合成技术获得Ⅶ型NDV F基因和O18型APEC的OmpA基因片段,使用同源重组技术将F基因插入到OmpA基因中,再将重组基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建嵌合表达质粒,对重组质粒中的插入基因序列进行测序鉴定;将序列正确的嵌合表达质粒转入大肠杆菌BL21(Rosetta)感受态细胞中,利用IPTG诱导嵌合蛋白表达,使用SDS-PAGE和Western-blot检验嵌合蛋白的表达情况;纯化嵌合蛋白后免疫兔获得抗血清,抗血清再经抗原亲和纯化层析柱纯化获得多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗体效价。结果表明:成功合成了Fo和OmpA1、OmpA2基因片段,构建并表达了重组质粒pGEX-O1-Fo-O2,纯化后的嵌合蛋白O1FoO2在大肠杆菌中以包涵体形式存在,制备的多克隆抗体对O1FoO2的效价约为1.1×10^(6),对GST的效价约为4.1×10^(4)。说明制备的嵌合蛋白和双特异性抗体质量较好。 展开更多
关键词 新城疫病毒F蛋白 大肠杆菌ompa蛋白 嵌合蛋白 原核表达 多克隆抗体
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鸭疫里默氏菌OmpA与鸭IL-2融合基因的克隆与原核表达 被引量：2
6
作者 高云航 刘佳丽 +3 位作者 王巍 李秋菊 张福君 马红霞 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2014年第8期42-46,共5页
以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因... 以鸭疫里默氏菌吉林分离株JL-RA1OmpA基因(登录号HQ707077)和鸭DuIL-2成熟片段基因(登录号AY193713)为模板,分别设计带有linker的特异性引物,PCR扩增出序列大小为1182bp的OmpA-linker基因和序列大小为381bp的linkerDuIL-2成熟蛋白基因。利用SOE-PCR技术,成功构建OmpA-DuIL-2融合基因,片段大小为1551bp。将其转入大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建pET-OmpA-DuIL-2融合表达载体,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析得到分子量大小约为61 kDa的融合蛋白,经Western-blot分析该融合基因同时具OmpA和DuIL-2的反应原性。 展开更多
关键词 鸭疫里默氏菌 ompa基因 DuIL-2基因 ompa-DuIL-2融合基因 原核表达
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副溶血弧菌ompA基因缺失株的生物学特性及致病性分析 被引量：10
7
作者 白雪瑞 王权 +4 位作者 陈永军 万莹 凌娇 王亚磊 蒋蔚 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期902-910,共9页
[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶... [目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 ompa 缺失株 生物学特性 致病性
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迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA原核表达及其免疫原性研究 被引量：9
8
作者 张志强 杨楠 +5 位作者 李永慧 王洪彬 冯东青 吴同垒 史秋梅 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期534-537,共4页
为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白... 为研究迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA免疫保护性,本研究利用PCR方法扩增迟缓爱德华菌ompA基因,构建重组载体pET-32a-ompA,将其转化大肠杆菌BL21后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约58 ku;将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以迟缓爱德华菌强毒株ET-13攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为55%。本研究克隆了迟缓爱德华菌ompA基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供一定保护,为重组OmpA蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 迟缓爱德华菌 外膜蛋白 ompa 蛋白表达 免疫保护力
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不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的克隆及比较研究 被引量：7
9
作者 张海月 康元环 +4 位作者 陈龙 王惠 张冬星 单晓枫 钱爱东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期607-610,共4页
为系统研究维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ(OMPAⅠ),对不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因进行了克隆,获得了1 000 bp左右的目的基因,并对其序列进行了比较分析。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的核苷酸序列均具有OMP_b-brl和O... 为系统研究维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ(OMPAⅠ),对不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因进行了克隆,获得了1 000 bp左右的目的基因,并对其序列进行了比较分析。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的核苷酸序列均具有OMP_b-brl和OmpA_C-like保守结构域,其核苷酸序列同源性在93.6%以上,说明不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ具有一定的保守性。研究结果为维氏气单胞菌疫苗的研制提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 维氏气单胞菌 不同动物源性 ompaⅠ基因 同源性分析
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奶牛流产鹦鹉热衣原体ompA基因的克隆与原核表达 被引量：6
10
作者 宋竹青 邱昌庆 +6 位作者 周继章 曹小安 蔺国珍 郑福英 宫晓炜 王光华 魏彦明 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期140-143,共4页
目的表达奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用套式PCR方法扩增出了奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因完整片段,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SD... 目的表达奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用套式PCR方法扩增出了奶牛源鹦鹉热衣原体ompA基因完整片段,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组目的蛋白的表达结果。结果重组蛋白经奶牛衣原体阳性血清鉴定正确。结论ompA基因在原核表达系统中得到正确表达。 展开更多
关键词 鹦鹉热衣原体 ompa基因 克隆 原核表达 奶牛
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鸡源鸭疫里默杆菌的分离鉴定及ompA基因遗传进化分析 被引量：7
11
作者 李富祥 赵文华 +2 位作者 宋建领 朱建波 杨仕标 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期253-258,共6页
从病死鸡肝脏中分离到8株革兰阴性多形杆菌,对8株分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并分析ompA基因及其推导的蛋白序列遗传进化特征。16S rDNA进化分析显示,8株鸡源分离株与22株鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)参考株形成... 从病死鸡肝脏中分离到8株革兰阴性多形杆菌,对8株分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并分析ompA基因及其推导的蛋白序列遗传进化特征。16S rDNA进化分析显示,8株鸡源分离株与22株鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)参考株形成一个大的进化分支,与RA模式菌株ATCC11845和22株RA参考株之间的同源性分别为99.3%~99.8%和98.8%~100.0%。根据形态学和16S rDNA基因鉴定结果,将8株分离株鉴定为RA。ompA基因进化分析显示,8株鸡源RA分离株与3株鸭源RA分离株KML1、KML2、KML3以及1株鹅源RA分离株KS9901-G形成一个大的进化分支,同源性为94.0%~99.6%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株ompA基因均发生99个核苷酸位点的突变。OmpA蛋白进化分析显示,8株鸡源RA分离株形成一个独立的大的进化分支,同源性为100%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株OmpA蛋白均发生19个氨基酸位点的突变。8株鸡源RA分离株对青霉素、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩等10种抗生物敏感。本试验在国内分离到鸡源RA,证实鸡RA感染在我国的存在,对鸡RA感染的预防和控制具有重要指导意义。 展开更多
关键词 鸭疫里默杆菌 鸡 16S rDNA ompa基因
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赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达 被引量：6
12
作者 朱海龙 鲍朗 +2 位作者 张会东 王晓樱 李岩 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期294-297,共4页
目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序... 目的分析赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22的结构特征,并对其进行克隆表达。方法分别以问号状赖型钩体017株、56601株及双曲状钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建Loa22基因与质粒pGEX-4T-1的重组原核表达质粒,克隆筛选并测序。利用Bioedit、Dnaman、PSIPRED、NCBI及SignaIP等对其结构进行分析。最后在大肠杆菌JM109中诱导表达目的蛋白。结果不同毒力赖型钩体均能扩增出约600bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pGEX-Loa22构建成功:分析显示不同赖型钩体的Loa22的同源性很高,C末端都具有同OmpA一致的保守序列及肽聚糖相关基序,都有信号肽序列;表达产物经SDS-PAGE检测证明是目的蛋白。结论赖型钩体具有编码OmpA膜蛋白的Loa22基因,可能与赖型钩体毒力和免疫原性存在某种相关性。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 ompa基因 克隆 表达
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牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH和OmpA重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果 被引量：5
13
作者 田亮 康立超 +2 位作者 赵文娟 薄新文 马勋 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期146-151,共6页
为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)外膜蛋白H(OmpH)和外膜蛋白A(Om-pA)的免疫效果,构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH和OmpA的原核表达载体pET-28a-OmpH和pET-28a-OmpA,表达并纯化重组外膜蛋白H(rOmpH)和重组外膜蛋白A(r... 为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)外膜蛋白H(OmpH)和外膜蛋白A(Om-pA)的免疫效果,构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌OmpH和OmpA的原核表达载体pET-28a-OmpH和pET-28a-OmpA,表达并纯化重组外膜蛋白H(rOmpH)和重组外膜蛋白A(rOmpA),制备相应的单价疫苗和二价疫苗(rOmpH-A)以及全菌灭活疫苗,以PBS作为对照,皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA检测抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离菌株进行攻毒,比较保护力。结果,各试验组均能产生特异性抗体,全菌灭活组和rOmpA组小鼠的存活率分别为80%、40%,而rOmpH组、rOmpH-A组小鼠全部死亡,rOmpH和rOmpH-A组仅推迟小鼠死亡的时间,说明保护力微弱,不能抵抗同源菌株的致死性攻击。结果表明,rOmpA蛋白具有保护力,而rOmpH不具有保护力。 展开更多
关键词 牦牛 多杀性巴氏杆菌 ompa基因 ompH基因 重组蛋白
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嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析 被引量：7
14
作者 蒋蔚 刘永杰 陆承平 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期301-306,共6页
以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板，根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物，扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段，定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中，重组质粒经限制... 以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板，根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物，扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段，定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中，重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明，插入片段长度为948bp，与NCBI上登录的几个相关序列相比，同源性在93．1％-95％之间，缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3），经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白，凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot，在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清，ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示，该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应，说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性，而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学，2008，15（2）：301—306] 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 ompa融合蛋白 表达 免疫原性
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鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达 被引量：4
15
作者 周祖涛 陈芬芬 +6 位作者 李自力 胡思顺 孙淑娜 吴仁蔚 肖运才 许青荣 毕丁仁 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期20-23,共4页
利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性... 利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株(RA-YM),根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。 展开更多
关键词 鸭疫里默氏杆菌 ompa基因 克隆 原核表达
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11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析 被引量：4
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作者 高明燕 徐步 +3 位作者 龚建森 王鑫 范建华 刘学贤 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期951-956,共6页
为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurellamultocida，Pm）OmpA基因的变异情况，参考Gen-Bank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物，采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A，B，D）的OmpA基因进行扩增，将... 为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurellamultocida，Pm）OmpA基因的变异情况，参考Gen-Bank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物，采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A，B，D）的OmpA基因进行扩增，将各菌株纯化回收的扩增产物与pMDl8-T载体连接，筛选阳性克隆进行测序。结果表明：14个菌株的OmpA基因开放阅读框在1047～1077bp之间，其中长度为1062bp的有9个菌株；SignalIP4．0预测表明，信号肽均为N端21个氨基酸残基，成熟蛋白氨基酸残基数量在327～332之间，推测的分子量为35．19～36．35kD。与GenBank中12个菌株OmpA基因核苷酸序列比对及遗传进化分析发现，核苷酸同源性为85．3％～100％；氨基酸同源性为83．1％～100％；其中C48—1，1010，9003，890920，921012，xj等6个国内禽Pm分离株OmpA序列同源性为100％。由此可见国内禽Pm菌株OmpA基因非常保守。 展开更多
关键词 禽多杀性巴氏杆菌 ompa基因 序列分析 同源性
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大肠埃希菌外膜蛋白OmpA表达质粒构建和诱导条件优化 被引量：18
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作者 刘祥 李惠 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期14-19,共6页
目的:构建大肠埃希菌外膜蛋白OmpA原核表达载体,优化OmpA蛋白的表达条件。方法:通过分子克隆获得OmpA蛋白的表达菌株;采用正交试验,获得OmpA菌株的最佳表达条件与培养条件。结果:OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定与预测结果一致,Western... 目的:构建大肠埃希菌外膜蛋白OmpA原核表达载体,优化OmpA蛋白的表达条件。方法:通过分子克隆获得OmpA蛋白的表达菌株;采用正交试验,获得OmpA菌株的最佳表达条件与培养条件。结果:OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定与预测结果一致,Western Blot分析表明抗体能与OmpA蛋白结合;OmpA菌株最佳诱导表达条件为:IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时菌液OD600值0.8,28℃诱导8h;最佳培养条件为:葡萄糖浓度1%,转速230r/min,装液量50mL。结论:成功克隆OmpA基因,确定OmpA蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件。 展开更多
关键词 正交试验 ompa蛋白 诱导条件 数据分析
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羊流产嗜性衣原体重组ompA蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：3
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作者 付明哲 吴浩阳 +1 位作者 许信刚 张琪 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2184-2189,共6页
原核表达羊流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus,C.abortus)ompA蛋白,包被ompA蛋白抗原,筛选反应条件,成功建立了血清抗体ELISA检测方法。PCR扩增ompA蛋白基因并进行原核表达,经纯化、复性和Western blot鉴定后作为包被抗原,通过反应... 原核表达羊流产嗜性衣原体(Chlamydophila abortus,C.abortus)ompA蛋白,包被ompA蛋白抗原,筛选反应条件,成功建立了血清抗体ELISA检测方法。PCR扩增ompA蛋白基因并进行原核表达,经纯化、复性和Western blot鉴定后作为包被抗原,通过反应条件筛选、灵敏性、特异性、重复性检验和临床样品检测,创建了羊流产嗜性衣原体血清抗体间接ELISA检测方法。结果表明,建立pET-28α-ompA阳性质粒并表达约为40000的ompA蛋白,Western blot显示纯化复性的ompA蛋白具备抗原性与特异性。反应条件筛选结果为ompA蛋白包被360ng;血清及二抗分别稀释1∶50,1∶5000并37℃作用1h;TMB显色10min。在优化条件下,D450≥0.327为阳性,反之为阴性;特异性、敏感性和重复性结果显示,对布氏杆菌、羊痘、羊口疮、小反刍兽疫和产气荚膜梭菌阳性血清的检测结果均为阴性且50份流产性衣原体阳性血清检出率为98%,批内和批间D450值变异系数分别为1.56%~2.56%和2.35%~3.25%。应用建立的方法对临床175份血清检测,阳性率为52%,商品化衣原体间接血凝检测阳性率为49.1%,阳性符合率为96.5%。本试验建立的间接ELISA检测方法可用于羊流产性衣原体血清抗体水平检测。 展开更多
关键词 羊流产性衣原体 ompa蛋白 原核表达 间接ELISA
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奶牛流产衣原体OmpA抗原间接ELISA检测方法的建立 被引量：2
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作者 宋竹青 邱昌庆 +6 位作者 周继章 郑福英 蔺国珍 曹小安 王光华 宫晓炜 魏彦明 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期696-700,共5页
以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过... 以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过夜;ELISA的阴性、阳性临界值为0.391。用本方法和衣原体间接血凝试验检测奶牛血清田间样品206份,两者的符合率为95.3%。本试验建立的OmpA-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可为牛衣原体病的诊断及流行病学调查提供有效工具。 展开更多
关键词 牛 流产衣原体 重组ompa 间接酶联免疫吸附试验
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羊流产嗜衣原体ompA基因的克隆与表达 被引量：2
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作者 龙冲冲 江楠 +3 位作者 杨细桃 周碧君 罗意 文明 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期25-28,共4页
目的:克隆羊流产嗜衣原体ompA基因,获得原核表达ompA蛋白。方法:以前期构建的质粒pMD-18T-ompA为模板,扩增出无信号肽无终止子ompA基因1 101bp条带,亚克隆至原核表达载体pet-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),重组质粒稳定性测试合格后经1mmol... 目的:克隆羊流产嗜衣原体ompA基因,获得原核表达ompA蛋白。方法:以前期构建的质粒pMD-18T-ompA为模板,扩增出无信号肽无终止子ompA基因1 101bp条带,亚克隆至原核表达载体pet-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),重组质粒稳定性测试合格后经1mmol/L IPTG诱导表达4h,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达结果。结果:本试验成功获得60kDa重组ompA蛋白,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在,免疫印迹显示可与山羊流产嗜衣原体阳性血清反应,具有免疫原性。结论:成功建立ompA基因的原核表达方法,为后续ompA蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 流产嗜衣原体 ompa基因 克隆 原核表达 稳定性
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