人星状病毒I型非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表达及鉴定 被引量：1

1

作者 刘文慧 阚丽丽 +4 位作者 崔永胜 谭李倩 梁雪雪 李新 赵微 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期46-50,共5页

人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体。HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用。为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后... 人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体。HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用。为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后续蛋白相关研究提供平台,本研究在E.coli系统中进行人星状病毒非结构蛋白nsP1a及nsP1a/4蛋白的表达并对表达产物进行鉴定。首先将nsP1a及nsP1a/4基因克隆入原核表达载体PGEX-4T-1,构建nsP1a及nsP1a/4蛋白融合表达质粒;在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,摸索两种融合蛋白表达的最优条件并对表达蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明nsP1a蛋白在30℃,1mM IPTG诱导12h时,蛋白表达量达到最高;nsP1a/4蛋白在20℃,0.5mM IPTG诱导8h时,蛋白表达量达到最高。Western blot结果显示两种融合蛋白既可与nsP1a蛋白免疫血清发生特异性反应,也可被GST标签抗体所识别。本研究成功利用原核系统表达并鉴定了人星状病毒非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4,为进一步研究星状病毒非结构蛋白的功能及病毒的致病机制奠定基础。 展开更多

关键词 人星状病毒 非结构蛋白nsp1a nsp1a/4 原核表达 融合蛋白

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP1对猪体免疫抑制作用 被引量：6

2

作者 周业飞 曹珺 +2 位作者 李玉峰 王先炜 姜平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1597-1603,共7页

为了研究高致病性PRRSV NSP1蛋白的免疫作用,本研究将高致病性PRRSV NSP1重组腺病毒(rAd-NSP1)接种体外培养的猪肺泡细胞(PAM),用实时荧光定量PCR和ELISA方法分别检测IFN-γ和IL-10水平,结果为rAd-NSP1接种PAM细胞72h后可显著降低细胞... 为了研究高致病性PRRSV NSP1蛋白的免疫作用,本研究将高致病性PRRSV NSP1重组腺病毒(rAd-NSP1)接种体外培养的猪肺泡细胞(PAM),用实时荧光定量PCR和ELISA方法分别检测IFN-γ和IL-10水平,结果为rAd-NSP1接种PAM细胞72h后可显著降低细胞上清中IFN-γ的水平,而IL-10的含量显著提高。将rAd-NSP1接种无PRRSV感染的30日龄商品仔猪,分别检测其外周血液淋巴细胞增殖作用和IFN-γ与IL-10的水平,结果显示,NSP1可显著减低淋巴细胞增殖和IFN-γ的表达,同时诱导产生较强的IL-10反应。采用无PRRSV感染的30日龄商品仔猪免疫猪瘟疫苗后1周接种rAd-NSP1,结果猪瘟抗体的水平明显低于wtAd组(P<0.05),证明高致病性PRRSV NSP1蛋白具有免疫抑制作用。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp1 重组腺病毒 IFN-Γ IL-10

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A组轮状病毒NSP1基因克隆表达及免疫学性质研究 被引量：4

3

作者 魏海涛 张艳 +3 位作者 范耀春 李传印 文喻玲 陈元鼎 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期15-21,共7页

轮状病毒(rotavirus,RV)非结构蛋白1(non structural protein1,NSP1)在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。运用基因克隆和表达技术在大肠杆菌中表达了TB-Chen株RVNSP1蛋白,进行了NSP1的免疫学性质和RV感染细胞中NSP1蛋白的合成... 轮状病毒(rotavirus,RV)非结构蛋白1(non structural protein1,NSP1)在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。运用基因克隆和表达技术在大肠杆菌中表达了TB-Chen株RVNSP1蛋白,进行了NSP1的免疫学性质和RV感染细胞中NSP1蛋白的合成与分布以及NSP1的系统进化和基因分型研究。结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)能高效表达重组NSP1蛋白(rNSP1),rNSP1表达量约占菌体总蛋白的34.4%。rNSP1能诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体。Western blot及免疫荧光检测结果表明,抗rNSP1血清抗体能特异性识别自身蛋白,对SA11、Wa株的NSP1蛋白有交叉反应性;免疫荧光结果还表明,SA11感染的MA104细胞中合成的NSP1蛋白在细胞质中区域化聚集形成辐射状排列的颗粒状结构,而Wa株的NSP1不能形成此样结构。至今发现的A组RV至少可以分为16个不同的NSP1基因型,TB-Chen株NSP1为A2型。不同基因型有独特的敏感宿主范围,同一基因型可能感染不同种动物,同一种动物也可能感染不同基因型。基因型A4型和A16型仅在鸟类病毒株中出现;而且鸟类中只有A4型和A16型。研究结果为进一步研究NSP1蛋白质的结构功能及其应用开发奠定了很好的基础。 展开更多

关键词 轮状病毒 nsp1 重组表达 免疫学性质 基因分型

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轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3的影响 被引量：2

4

作者 冉旭华 刘阳阳 +2 位作者 曹思 张峣 闻晓波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第7期708-712,共5页

目的探讨轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的影响。方法将UK毒株感染人结肠腺癌细胞Caco-2 6、12、24 h后,通过实时定量PCR和Western blot检测细胞内源性IRF3在转录水平和蛋白... 目的探讨轮状病毒UK株NSP1蛋白对人源宿主细胞干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的影响。方法将UK毒株感染人结肠腺癌细胞Caco-2 6、12、24 h后,通过实时定量PCR和Western blot检测细胞内源性IRF3在转录水平和蛋白水平的变化;构建质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1和缺失IRF3结合结构域的质粒pCMV-3×FLAG-UK-NSP1△IRF3,分别单独转染及与p EGFP-N3-IRF3质粒共转染293T细胞4、8、12 h后,Western blot分析IRF3蛋白含量的变化。结果 IRF3 m RNA转录水平无明显变化,UK毒株感染组和NSP1质粒转染组IRF3蛋白含量均下降。结论 UK-NSP1能够介导人IRF3蛋白降解,且需要IRF3结合结构域参与。 展开更多

关键词 轮状病毒UK株 nsp1 干扰素调节因子3 免疫抑制

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猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对IFN-β激活的JAK/STAT信号通路的影响 被引量：3

5

作者 施开创 尹彦文 +1 位作者 陆文俊 屈素洁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期629-637,共9页

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白nsp1对干扰素(IFN)激活的Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的影响,将PEDV nsp1蛋白表达质粒转染HeLa细胞,并用IFN-β处理,应用Western-blot对STAT1、STAT2磷酸化以及早幼粒... 为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白nsp1对干扰素(IFN)激活的Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的影响,将PEDV nsp1蛋白表达质粒转染HeLa细胞,并用IFN-β处理,应用Western-blot对STAT1、STAT2磷酸化以及早幼粒细胞白血病蛋白(PML)表达水平进行检测,应用IFA试验对STAT1、STAT2核移位以及PML蛋白表达水平进行检测,应用双荧光素酶分析系统对干扰素刺激反应元件(ISRE)-Luc进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56以及PML转录水平进行检测。结果显示,nsp1蛋白过表达细胞内STAT1和STAT2的蛋白表达水平、磷酸化作用以及磷酸化STAT1(pSTAT1)、pSTAT2的核移位不受影响,而ISRE启动子的表达水平受到显著抑制,ISG15、ISG56转录水平显著下调,PML转录水平和蛋白表达水平显著降低。结果表明,PEDV nsp1蛋白可以抑制IFN-β激活的JAK/STAT信号通路。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 nsp1蛋白 Janus激酶/信号转导和转录激活因子信号通路 抑制

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牛轮状病毒UK株NSP1基因序列分析及原核表达 被引量：2

6

作者 冉旭华 曹思 +4 位作者 张峣 魏晓曼 闻晓波 倪宏波 朱战波 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第5期1104-1109,共6页

轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列... 轮状病毒是引起多种幼龄动物及5周龄以下儿童腹泻的主要病原体。NSP1非结构蛋白是轮状病毒基因5的产物,为长约55ku的RNA结合蛋白。现已发现NSP1蛋白是一种毒力决定因子,可颉颃宿主先天性免疫应答。参照GenBank收录的牛轮状病毒UK株序列设计并合成1对特异性引物,本试验利用RT-PCR方法扩增牛轮状病毒UK株NSP1基因,克隆入pET-28a(+)表达载体,经双酶切和测序鉴定,并利用分子生物学软件进行同源性比对分析。本试验结果显示获得的NSP1基因全长编码区序列为1 473bp,编码491个氨基酸,与美国WC3株同源性最高。将阳性重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析,结果表明重组蛋白分子质量约为55ku,以包涵体形式表达,可与鼠抗His-tag抗体反应。本试验成功获得牛轮状病毒UK株NSP1基因,且实现了在原核表达系统中高效表达重组蛋白,本试验结果为研究NSP1蛋白在细胞内定位与其活性之间的相互关系奠定了基础。 展开更多

关键词 牛轮状病毒UK株 nsp1 序列分析 原核表达

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需 被引量：2

7

作者 王超 史西保 +5 位作者 王丽 陈静 司朝朝 王爱萍 邓瑞广 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2032-2039,共8页

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。前期研究发现PRRSV能够激活NLRP3炎症小体,但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎症小体的组分还未见报道。本研究首先在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中,共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒,建立NLRP3炎症小体的体外研究模型。然后,在该炎症小体模型细胞和猪肺泡巨噬细胞中,转染PRRSV nsp1α的真核表达质粒,结果表明nsp1α能够明显拮抗炎症小体的活化,而进一步的突变试验表明缺失N端锌指(ZF)结构或者突变ZF结构的nsp1α均不能抑制NLRP3炎症小体活化。本研究不仅首次发现了拮抗NLRP3炎症小体活化的PRRSV蛋白——nsp1α,而且发现nsp1α的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需。本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制,并为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论指导。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp1α ZF结构域 NLRP3炎症小体 IL-1Β

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盖塔病毒非结构蛋白NSP1多克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

8

作者 张洁 李超凡 +1 位作者 翟晓风 粟硕 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期79-83,共5页

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体,用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因,构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达... 试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体,用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因,构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了NSP1蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10^(5)以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示,NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备,为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 多克隆抗体 nsp1基因 非结构蛋白 盖塔病毒

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轮状病毒非结构蛋白NSP1与宿主的相互作用 被引量：1

9

作者 刘凯军 李晋涛 《生命的化学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期563-565,共3页

轮状病毒(rotavirus,RV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSP1)是轮状病毒逃避宿主天然免疫应答的关键蛋白质。它可以与干扰素调控因子家族(interferon regulatoryfactor family,IRFF)的共同区域结合,阻断干扰素表达的信号通路,降... 轮状病毒(rotavirus,RV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSP1)是轮状病毒逃避宿主天然免疫应答的关键蛋白质。它可以与干扰素调控因子家族(interferon regulatoryfactor family,IRFF)的共同区域结合,阻断干扰素表达的信号通路,降低宿主细胞I型干扰素(type I interferon,IFN-I)的表达,从而抑制宿主天然抗病毒免疫机制的建立。因此,NSP1被认为是轮状病毒的一种重要毒力因子。本文综述了近年来轮状病毒NSP1与宿主相互作用的研究进展。 展开更多

关键词 轮状病毒 nsp1 天然免疫

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PRRSV Nsp1α蛋白结构及生物学功能研究进展 被引量：1

10

作者 李兴玉 李金海 +2 位作者 吴学婧 肖璐 康润敏 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第23期39-44,共6页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒,基因组全长约15 kb,病毒基因组编码11个开放阅读框(open reading frame, ORFs),其中ORF1a编码多聚蛋白pp1a, pp1... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒,基因组全长约15 kb,病毒基因组编码11个开放阅读框(open reading frame, ORFs),其中ORF1a编码多聚蛋白pp1a, pp1a通过自身的蛋白酶功能产生Nsp1α、Nsp1β、Nsp2~8蛋白。Nsp1α蛋白被认为是干扰素的拮抗剂,在抑制宿主干扰素产生过程中发挥着重要的作用,还在免疫调节、细胞凋亡等方面发挥作用。文章综述了Nsp1α蛋白结构及其生物学功能的研究进展,以期为PRRSV致病机制的研究及防治猪繁殖与呼吸综合征提供理论支撑。 展开更多

关键词 猪繁殖和呼吸综合征病毒 nsp1α蛋白 结构 生物学功能 干扰素

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兔出血症病毒NSP1的原核表达及亚细胞定位

11

作者 缪秋红 朱杰 +4 位作者 李传峰 梁瑞英 陈宗艳 孟春春 刘光清 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期124-128,共5页

为了研究兔出血症病毒非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSP1)的生物学特性,构建了含有NSP1基因的原核重组表达质粒pGEX-NSP1和与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒pEGFP-NSP1;原核诱导表达NSP1蛋白,并对其进行纯化;同... 为了研究兔出血症病毒非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NSP1)的生物学特性,构建了含有NSP1基因的原核重组表达质粒pGEX-NSP1和与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒pEGFP-NSP1;原核诱导表达NSP1蛋白,并对其进行纯化;同时利用脂质体介导方法将真核重组表达质粒瞬时转染兔肾细胞系,4,6-二脒基-2-苯基吲哚染细胞核后激光共聚焦观察NSP1在细胞内的表达和亚细胞定位情况。结果显示,原核诱导表达了含有GST标签的GST-NSP1蛋白,形成包涵体,大小约42ku;并且NSP1与增强型绿色荧光蛋白融合的蛋白定位于细胞质内。试验结果为深入探讨NSP1的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 nsp1 原核表达 亚细胞定位

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马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位

12

作者 靳亮 许翠萍 +5 位作者 王金昌 关丽梅 张稳超 黄朝 高学梅 王洪秀 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期208-214,共7页

马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原... 马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV)基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白(NSP1)。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原区(1-600 bp)进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白(101 k D)外,也检测到了80 k D和20 k D的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对Dp CPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。 展开更多

关键词 马尾松毛虫质型多角体病毒 nsp1 抗体制备 真核表达 细胞定位

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP1蛋白重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫抑制作用

13

作者 周业飞 李玉峰 +1 位作者 王先炜 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期1223-1227,共5页

利用RT-PCR扩增获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SY0608株非结构蛋白基因NSP1,将其克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,经PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒载体,再经PacⅠ线性化后... 利用RT-PCR扩增获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SY0608株非结构蛋白基因NSP1,将其克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,经PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒载体,再经PacⅠ线性化后转染至HEK-293A细胞,获得重组腺病毒,IFA和Western-blot鉴定结果证明其可以表达NSP1。将该重组腺病毒2次接种ICR小鼠,每次间隔2周,于免疫后不同时间取脾淋巴细胞进行体外培养,用于淋巴细胞增殖试验,并用ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结果显示,与野生型腺病毒(wtAd)或DMEM对照组相比,重组腺病毒rAd-NSP1组T淋巴细胞增殖指数(SI)和IFN-γ水平显著降低,IL-10水平明显增高(P<0.05)。结果表明,高致病性PRRSV NSP1蛋白具有明显的免疫抑制作用。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 nsp1 重组腺病毒 IFN-Γ

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)突变体的构建及活性鉴定

14

作者 赵鹏伟 吴家强 +8 位作者 杜以军 李俊 孙文博 丛晓燕 时建立 彭军 于江 刘月月 王金宝 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第6期1-6,共6页

本试验旨在构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SX-1株非结构蛋白Nsp1的真核表达质粒,并对Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)进行定点突变,检测其在真核细胞中的表达活性。利用TRIzol法提取总RNA,RT-PCR扩增Nsp1目的基因,经双酶切构建pC... 本试验旨在构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)SX-1株非结构蛋白Nsp1的真核表达质粒,并对Nsp1蛋白锌指结构1(ZF1)进行定点突变,检测其在真核细胞中的表达活性。利用TRIzol法提取总RNA,RT-PCR扩增Nsp1目的基因,经双酶切构建pCI-neo-Nsp1真核表达质粒后对Nsp1蛋白锌指结构1的8C、10C、25C和28C的4个位点进行定点突变,成功获得分别突变为A和S的8个突变体。转染HeLa细胞,通过间接免疫荧光方法(IFA)和Western blotting检测Nsp1蛋白的活性。IFA结果显示,Flag抗体检测时蛋白质主要分布在细胞质和细胞核中,Myc抗体检测时蛋白质主要分布在细胞核中。Western blotting结果显示,Flag抗体检测时,S突变体出现大小约为44和20ku条带,A突变体出现约为44ku条带;Myc抗体检测时,S突变体出现大小约为44和27ku条带,A突变体出现大小约为44ku条带。试验结果表明,本试验成功构建了Nsp1突变体的真核表达质粒,证实其能在真核细胞中表达,为进一步研究Nsp1蛋白的锌指结构是否对机体Ⅰ型IFN产生起下调作用提供基础。 展开更多

关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株 nsp1 突变体构建 活性鉴定

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百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的相互作用 被引量：4

15

作者 胡晓晶 储晓洁 +2 位作者 康恒 朱辉 张忠明 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期132-137,共6页

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家... 豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSP1的GRAS结构域的LHRII区域和NSP2的LHRI区内。 展开更多

关键词 百脉根 结瘤信号通道蛋白nsp1 结瘤信号通道蛋白NSP2 共生信号转导 酵母双杂交

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人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 被引量：1

16

作者 李攀 张成 +5 位作者 杨思达 崔成成 刘志成 曾韦锟 黄芬 井申荣 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第11期1127-1131,共5页

目的原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体。方法酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3)... 目的原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体。方法酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件。表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,最后1次免疫7 d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性。结果重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6%,浓度为1.26mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶30 000,且特异性较好。结论成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 人星状病毒 nsp1a/3 原核细胞 基因表达 纯化 多克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较 被引量：1

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作者 杨霞 王爽云 +8 位作者 于林洋 徐舸 郑继豪 王志朋 张歆明 刘燕玲 张乐宜 徐铮 宋长绪 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第3期73-78,共6页

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将... 为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) nsp1基因 nsp5基因 N基因 重组腺病毒 免疫原性 构建 鉴定

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猪星状病毒nsP1a/4蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：1

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作者 刘燚 董覃婷 +6 位作者 朱鑫玥 张广欣 吴奥祺 陈樱 欧阳康 韦祖樟 黄伟坚 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第21期75-79,共5页

为了获得猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)重组蛋白nsP1a/4和多克隆抗体nsP1a/4,试验采用PCR技术扩增得到nsP1a/4基因片段,通过双酶切技术鉴定重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a。利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白nsP1a/4,... 为了获得猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)重组蛋白nsP1a/4和多克隆抗体nsP1a/4,试验采用PCR技术扩增得到nsP1a/4基因片段,通过双酶切技术鉴定重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a。利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白nsP1a/4,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白nsP1a/4表达情况及可溶性。利用Ni-Agarose Resin纯化重组蛋白nsP1a/4,再通过Western-bolt验证。以纯化的重组蛋白nsP1a/4免疫健康新西兰大白兔制备多克隆抗体nsP1a/4,通过Western-bolt检验多克隆抗体nsP1a/4的特异性。结果表明:试验扩增出nsP1a/4基因片段,成功构建出重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a,重组蛋白nsP1a/4以包涵体形式在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中大量表达。经Ni-Agarose Resin纯化的重组蛋白nsP1a/4单一,Western-bolt成功鉴定到重组蛋白nsP1a/4,多克隆抗体nsP1a/4能与重组蛋白nsP1a/4发生特异性结合。说明试验成功制备出PAstV的多克隆抗体nsP1a-4。 展开更多

关键词 猪星状病毒 非结构蛋白 nsp1a/4基因 原核表达 多克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒NSP1蛋白在细胞器中定位特性

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作者 季朝阳 张莎 +4 位作者 石达 陈建飞 时洪艳 张鑫 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期842-844,共3页

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFPNSP1。将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表... 为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白1(NSP1)在Vero E6细胞中的分布和亚细胞定位情况,本研究采用RT-PCR方法扩增NSP1基因,并将其克隆至真核表达载体pAcGFP-C1中构建重组质粒pAcGFPNSP1。将pAcGFP-NSP1转染至Vero E6细胞中进行瞬时表达,并收集转染后48 h的细胞进行western blot检测。通过激光共聚焦显微镜观察NSP1在细胞中的定位情况。结果表明,NSP1在Vero E6细胞中表达,其主要定位于细胞质中,与细胞中的线粒体、内质网、高尔基体均呈现高度共定位。本研究在Vero E6细胞中表达了PEDV NSP1蛋白,并首次对其亚细胞定位进行了解析,为进一步了解病毒的复制及其致病机制的研究提供了依据。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 nsp1 VERO E6细胞 亚细胞定位

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新冠病毒Nsp1蛋白结构与功能的生物信息学分析及原核表达 被引量：6

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作者 刘玲 李璟 +7 位作者 范蕾 宣焱 杜淼 张德玖 李卓禧 陈晓聪 杨娅男 徐本锦 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期566-576,共11页

目的Nsp1是新冠病毒的主要毒力因子,介导了病毒在宿主细胞中的免疫逃逸,扩大了病毒感染范围。本研究对Nsp1进行系统生信分析及原核表达,有助于全面理解该蛋白在新冠病毒侵染宿主细胞中的分子机理。方法采用Pfam、TMHMM、ProtScale、ExP... 目的Nsp1是新冠病毒的主要毒力因子,介导了病毒在宿主细胞中的免疫逃逸,扩大了病毒感染范围。本研究对Nsp1进行系统生信分析及原核表达,有助于全面理解该蛋白在新冠病毒侵染宿主细胞中的分子机理。方法采用Pfam、TMHMM、ProtScale、ExPASy和SignalP 4.0等工具对Nsp1的翻译后修饰、理化性质、跨膜螺旋、相互作用网络、同源性及进化特点等进行系统分析;利用分子克隆技术构建重组表达载体pET-22b-Nsp1并进行原核表达。结果Nsp1由180个氨基酸组成,分子量19.78 kDa,等电点为5.36,不稳定指数28.83,在哺乳动物中的半衰期约30 h,在大肠杆菌内超过10 h,有12个可能的磷酸化位点和3个O-糖基化位点,无信号肽和跨膜螺旋,亲水性较强;二级结构分析显示,Nsp1中无规则卷曲占比最高(45.00%),其次是α螺旋(25.56%)和延伸链(20.56%),β-转角占比最低(8.89%);序列对比和进化分析显示,与SARS-CoV-2 Nsp1序列一致性最高的是蝙蝠非典型冠状病毒WIV1(85.0%);原核表达发现Nsp1主要在沉淀中表达,经质谱鉴定目的蛋白就是Nsp1。结论本研究为新冠病毒Nsp1的表达、纯化及功能分析提供了重要借鉴,有助于进一步揭示Nsp1的生物学功能及开展相关抑制剂和抗病毒药物的研发。 展开更多

关键词 新冠病毒 nsp1蛋白 生信分析 结构与功能 进化分析

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