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易错PCR技术改造黑曲霉β-甘露聚糖酶的耐温性
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作者 陈晓飞 李珊珊 +3 位作者 周伏忠 刘德海 王佰涛 刁文涛 《中国饲料》 北大核心 2025年第17期53-60,共8页
为改造黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶基因Man26A,获得耐温性重组β-甘露聚糖酶,本试验通过易错PCR技术(在PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2)),将目的基因Man26A克隆至载体pGAPZαA上,构建重组质粒pGAPZαA-Man26A,将重组质粒电转化至毕赤酵... 为改造黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶基因Man26A,获得耐温性重组β-甘露聚糖酶,本试验通过易错PCR技术(在PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2)),将目的基因Man26A克隆至载体pGAPZαA上,构建重组质粒pGAPZαA-Man26A,将重组质粒电转化至毕赤酵母GS115中,在含有100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选耐温性突变体,并测定重组酶的酶学性质。本试验筛选出2株产耐温性β-甘露聚糖酶的重组突变体3-228和4-59,两重组酶的最适pH和温度分别为5.0和45℃,均与野生型酶相同,但与野生型相比,两重组酶的工作温度范围更加宽泛,且温度稳定性显著提高;金属离子Fe^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)、K+、Ca^(2+)、Co^(2+)对β-甘露聚糖酶活力有不同程度的激活作用,SDS、EDTA、Cd^(2+)、Cu^(2+)、Ni^(2+)、Ag^(2+)、Fe^(3+)、Pb^(2+)等对酶活力有不同的抑制作用。2个耐温性重组β-甘露聚糖酶均具有工作温度范围广、耐温性强等特点,提高了其在饲料工业上的应用潜力,证明了易错PCR技术是提高酶温度稳定性的有效方法。 展开更多
关键词 Β-甘露聚糖酶 易错pcr 耐温性 酶学性质
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转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体实时荧光定量PCR检测方法的研究
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作者 张月秋 傅芳奇 +9 位作者 张华 陈一帆 王晨尧 蒋红叶 李亚辉 廖一尘 王丹 孙宇 付伟 陈红 《生物技术进展》 2025年第2期276-286,共11页
转化体标准化检测方法为生物育种产业化的应用和定量标识制度实施提供了重要的技术支撑。基于插入序列左边界的信息,以耐除草剂大豆LP012-1转化体为研究对象,建立了实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法。以外源... 转化体标准化检测方法为生物育种产业化的应用和定量标识制度实施提供了重要的技术支撑。基于插入序列左边界的信息,以耐除草剂大豆LP012-1转化体为研究对象,建立了实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法。以外源插入序列位点左边界为靶标序列设计引物及其相应的探针,筛选获得了最优的引物组合,并优化引物探针浓度和退火温度,确定线性动力学范围在0.018~100 ng,检出限和定量限分别为0.05%、0.10%;正确度、精密度、实验室内稳健性和实验室间的联合验证误差均小于25%。研究建立的qPCR检测方法特异性好、灵敏度高、稳健性强,可以为耐除草剂转基因大豆LP012-1的安全监管提供技术支撑,并服务于生物育种商业化。 展开更多
关键词 转基因大豆 实时荧光定量pcr LP012-1转化体
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转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体普通PCR定性检测方法的研究
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作者 张月秋 傅芳奇 +8 位作者 赵桐桐 陈子言 裴欣瑶 高芳瑞 李佳岢 李辉 江晓丹 王颢潜 陈红 《生物技术进展》 2025年第3期466-475,共10页
转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体由我国企业自主研发,具有广阔的生物育种产业化应用前景。通过建立LP012-1转化体的定性检测方法,可为标识管理和安全监管提供有力支撑。基于此,从优化DNA提取方法、设计转化体特异性引物并优化引物浓度... 转基因耐除草剂大豆LP012-1转化体由我国企业自主研发,具有广阔的生物育种产业化应用前景。通过建立LP012-1转化体的定性检测方法,可为标识管理和安全监管提供有力支撑。基于此,从优化DNA提取方法、设计转化体特异性引物并优化引物浓度和退火温度、验证方法特异性、测试检出限以及其稳健性等方面构建LP012-1转化体的普通PCR定性检测方法。研究建立了灵敏度高、特异性好的LP012-1转化体检测方法,填补了该转化体定性检测方法的空白,可为后期的规范管理和推广应用提供支持。 展开更多
关键词 转基因耐除草剂大豆 pcr定性检测 LP012-1转化体
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调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌叠氮溴化丙锭-实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 宋帆 《现代食品》 2025年第7期209-214,共6页
为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量... 为缩短检测周期,排除死菌DNA的干扰,采用实时荧光定量PCR对调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。方法:采用叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)鉴别死活菌,检测目标菌中的特异性基因片段,构建利用PMA预处理结合实时荧光定量PCR的特异性检测方案。结果:在PMA工作浓度为40μg·mL^(-1)、暗孵育时间为10 min、曝光时间为20 min的最佳方案下处理,可在不影响目标活菌正常扩增的同时抑制死菌的干扰。本方法快速准确,检验周期可缩短到48 h,在1.2×10^(3) CFU·mL^(-1)菌量下仍能有效检出目标菌。结论:本方法特异性强、灵敏度高,适用于突发事件中检测调理肉制品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌。 展开更多
关键词 调理肉制品 小肠结肠炎耶尔森氏菌 叠氮溴化丙锭-实时荧光定量pcr
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Development of Multi-PCR for Differentiation of Vaccine Strain and Field Isolate of Porcine Pseudorabies Virus 被引量:2
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作者 蔺芳 尹双辉 +2 位作者 尚佑军 刘艳红 刘湘涛 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2009年第2期36-38,46,共4页
Three pairs of primer were designed for amplification of porcine pseudorabies virus (PRV) gB, gE, and TK gene by multiplex PCR (multi-PCR) in order to differentiate vaccine strains from field isolates. Three speci... Three pairs of primer were designed for amplification of porcine pseudorabies virus (PRV) gB, gE, and TK gene by multiplex PCR (multi-PCR) in order to differentiate vaccine strains from field isolates. Three specific bands were obtained respectively at the expected size, 427 bp (gB gene), 298 bp (gEgene), and 208 bp (TKgene), Then four different gene-deleted vaccines of PRV were detected by multi-PCR. One ex- pected specific band was observed in one of samples, while two bands in the others. As shown by the detection results, the multi-PCR has high sensitivity and specificity and should be applied in pathogen diagnosis and epidemiological investigation in the future. 展开更多
关键词 Porcine pseudorabies virus multi-pcr Differentiation detection
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抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体特异性定性PCR检测方法的建立及其标准化 被引量:2
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作者 肖芳 李允静 +5 位作者 武玉花 李俊 高鸿飞 翟杉杉 吴刚 梁晋刚 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1148-1156,共9页
抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已经批准获得我国进口用作加工原料的安全证书,含有外源HaHB4基因和bar标记基因。本研究根据抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端和3′端插入位点旁侧序列信息,设计19对引物,结合罗萨里... 抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5已经批准获得我国进口用作加工原料的安全证书,含有外源HaHB4基因和bar标记基因。本研究根据抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体5′端和3′端插入位点旁侧序列信息,设计19对引物,结合罗萨里奥农业生物技术学院公司的1对引物,针对20对引物组合利用定性PCR技术进行引物特异性筛选,结果显示5′端的14号引物特异性良好,优化后获得最佳反应体系和反应程序;经测试,该引物特异性好、稳定性高,检出限达0.1%,扩增片段大小248 bp。经8家有资质实验室对本方法的特异性、检出限、重复性和再现性进行验证,各项参数均达到国家标准要求。本研究成功建立了抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5转化体定性PCR检测方法,为IND-ØØ41Ø-5转化体在国内的安全监管提供技术支撑。 展开更多
关键词 转基因 抗逆大豆IND-ØØ41Ø-5 转化体特异性 定性pcr
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单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 张天姿 王瑞晨 +6 位作者 付士红 李樊 殷启凯 李海 聂凯 王环宇 许松涛 《中国热带医学》 CAS 北大核心 2024年第3期340-348,共9页
目的建立单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的双重微滴式数字PCR检测方法。方法基于单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的保守区域,设计特异性引物探针,通过筛选引物探针组合,优化双重微滴式数字PCR反应退火温度及引物探针浓度比,... 目的建立单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的双重微滴式数字PCR检测方法。方法基于单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒的保守区域,设计特异性引物探针,通过筛选引物探针组合,优化双重微滴式数字PCR反应退火温度及引物探针浓度比,建立双重单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测反应体系,对其他病毒进行检测,对临床样本进行验证,对建立的双重微滴式数字PCR方法的灵敏性、特异性及重复性进行分析。结果单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR检测方法最佳引物和探针浓度分别为800 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度是56℃;双重微滴式数字PCR检测方法的标准曲线相关系数(R2)为0.99,呈现良好的线性关系;灵敏度高,单纯疱疹病毒Ⅰ型最低检测下限为2.97拷贝/µL,水痘-带状疱疹病毒最低检测下限为2.73拷贝/µL;重复性好,变异系数小,检测结果稳定;特异性强,未发现与单纯疱疹病毒Ⅱ型、EB病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、人巨细胞病毒、肠道病毒71型、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒以及人类核酸有交叉反应。结论本试验建立的单纯疱疹病毒Ⅰ型和水痘-带状疱疹病毒双重微滴式数字PCR方法灵敏性强、特异性高、重复性好,可为不同场景下2种病毒的快速定量检测提供解决方案。 展开更多
关键词 单纯疱疹病毒Ⅰ型 水痘-带状疱疹病毒 双重微滴式数字pcr 定量检测
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A1/A2β-酪蛋白基因型的鉴定及其消化性能的比较 被引量:1
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作者 李师行 徐洪涛 +6 位作者 李笑 孙美玲 杨鑫焱 项鹏宇 杨智浩 满朝新 姜毓君 《食品工业科技》 北大核心 2025年第5期160-167,共8页
A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白由于一级结构上的差异,消化后产生的物质也不相同。为了更全面地探究其对人体可能产生的生物活性影响,通过分析和监测该蛋白质在消化过程中的变化情况,进一步实现对A1/A2β-酪蛋白生物功能的探索。在本研究中,... A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白由于一级结构上的差异,消化后产生的物质也不相同。为了更全面地探究其对人体可能产生的生物活性影响,通过分析和监测该蛋白质在消化过程中的变化情况,进一步实现对A1/A2β-酪蛋白生物功能的探索。在本研究中,对采自某一牧场不同奶牛的牛奶进行等位基因特异性PCR鉴别,并借助阴离子交换色谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法对牛奶分离出的β-酪蛋白进行纯化和鉴定,最后构建静态体外消化模型比较β-酪蛋白在消化性能上的差异。结果显示,分离纯化的A1和A2β-酪蛋白的浓度分别为0.62 mg/mL和0.66 mg/mL,纯度分别为95.28%和96.60%。两种β-酪蛋白的最终消化率均在90%左右,差异不显著。A2β-酪蛋白自肠消化阶段开始直至消化结束表现出了更高的水解度,为25.34%。随着胃肠消化时间的增加,两种β-酪蛋白的粒径不断减小,电位绝对值不断增大,并且A2β-酪蛋白在粒径和电位上的变化程度大于A1β-酪蛋白。综上所述,本研究揭示了A1和A2β-酪蛋白在静态体外消化过程中的理化特性差异,并在一定程度上表明A2β-酪蛋白可能具有比A1β-酪蛋白更好的消化性能,为进一步拓宽A2β-酪蛋白在乳制品中的应用提供一定科学依据。 展开更多
关键词 A1 Β-酪蛋白 A2 Β-酪蛋白 等位基因特异性pcr 体外模拟消化 消化性能
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大蒜叶片蜡质成分分析及蜡质缺失基因Ggl-1筛选
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作者 刘泽洲 段乃彬 +4 位作者 岳丽昕 王清华 姚行浩 高莉敏 孔素萍 《生物技术通报》 北大核心 2025年第9期219-231,共13页
【目的】分析大蒜蜡质缺失突变体8684-gl叶表蜡质缺失成分,筛选蜡质缺失基因Ggl-1,为探讨大蒜叶片表面蜡粉的分子调控机制奠定基础,也可为大蒜抗病虫害育种及其在生产实践中的应用提供理论基础。【方法】以大蒜蜡质缺失突变体8684-gl和... 【目的】分析大蒜蜡质缺失突变体8684-gl叶表蜡质缺失成分,筛选蜡质缺失基因Ggl-1,为探讨大蒜叶片表面蜡粉的分子调控机制奠定基础,也可为大蒜抗病虫害育种及其在生产实践中的应用提供理论基础。【方法】以大蒜蜡质缺失突变体8684-gl和野生型8684植株叶片为研究对象,利用气相色谱-质谱联用(gas chromatograph-mass spectrometer-computer,GC-MS)分析大蒜蜡质缺失突变体8684-gl及其野生型8684叶片表面的蜡质成分,通过转录组和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)筛选蜡质缺失基因Ggl-1。【结果】通过GC-MS分析发现,大蒜叶片表面蜡质包含39个成分,8684-gl突变体叶片表面蜡质缺失的主要物质为16-庚烯酮(16-hentriacontanone,C_(31)H_(62)O)。转录组分析结果显示,蜡质缺失突变体8684-gl及其野生型8684间差异表达基因主要集中在脂质转运与代谢、脂肪酸生物合成降解过程以及次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢等过程,蜡质缺失基因Ggl-1的候选基因为Asa8G04000和Asa4G02100,RT-q PCR结果显示,候选基因表达量在蜡质缺失突变体8684-gl及其野生型8684叶片中差异显著。【结论】蜡质缺失突变体8684-gl叶片表面蜡质缺失主要物质为16-庚烯酮,筛选到Asa8G04000和Asa4G02100为大蒜蜡质缺失基因Ggl-1的候选基因。 展开更多
关键词 大蒜 蜡质缺失 气相色谱-质谱联用 蜡质成分 转录组测序 实时荧光定量pcr 候选基因
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羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立
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作者 刘尚博 王振华 +1 位作者 郑可 秦建华 《今日畜牧兽医》 2024年第8期1-4,共4页
为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种... 为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。 展开更多
关键词 布氏杆菌 M5-90△26疫苗株 双重实时荧光定量pcr 鉴别诊断
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桉叶油醇和α-松油醇复配对赤拟谷盗的抗虫作用机制研究 被引量:2
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作者 刘倩影 张佳琪 +4 位作者 刘琛 耿珠峰 尤春雪 刘鼎阔 张文娟 《中国粮油学报》 北大核心 2025年第2期1-8,共8页
本研究以桉叶油醇、α-松油醇为研究对象,探究化合物单体及复配对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的杀虫作用机制。结果显示,桉叶油醇、α-松油醇对赤拟谷盗具有触杀作用,且二者4∶6复配时杀虫效果增强,LD 50为20.30μg/头;结合分子对接... 本研究以桉叶油醇、α-松油醇为研究对象,探究化合物单体及复配对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的杀虫作用机制。结果显示,桉叶油醇、α-松油醇对赤拟谷盗具有触杀作用,且二者4∶6复配时杀虫效果增强,LD 50为20.30μg/头;结合分子对接技术对赤拟谷盗解毒酶进行筛选,发现桉叶油醇、α-松油醇及复配对代谢型谷氨酸受体样蛋白(TcMGRP)结合较为稳定,结合能分别为-6.53、-6.79、-11.49 kJ/moL;此外,实时荧光定量PCR(RT-PCR)结果显示,随着桉叶油醇、α-松油醇单体及复配(4∶6)处理时间的延长,TcMGRP的基因表达量逐渐下降,呈时间依赖性,而且,在6、12 h时,桉叶油醇、α-松油醇4∶6复配作用下赤拟谷盗TcMGRP基因表达量显著高于单体化合物的作用(P<0.05)。桉叶油醇、α-松油醇单体及复配(4∶6)通过抑制赤拟谷盗TcMGRP基因的表达发挥杀虫作用。 展开更多
关键词 桉叶油醇 Α-松油醇 复配 赤拟谷盗 触杀活性 实时荧光定量pcr 分子对接
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诺如病毒GⅡ.2和GⅡ.17型RNA假病毒标准物质制备及逆转录数字PCR方法建立
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作者 刘明伟 李会杰 +2 位作者 马成 杨佳怡 董莲华 《计量学报》 北大核心 2025年第6期917-924,共8页
诺如病毒感染导致急性胃肠炎,对于免疫缺陷的人群危害更加明显。针对诺如病毒GⅡ.2和GⅡ.17,采用慢病毒包装系统,开发了含有ORF2 RNA的假病毒核酸标准物质。建立并优化基于逆转录-数字PCR技术的定量检测方法。2种标准物质具有较好的均... 诺如病毒感染导致急性胃肠炎,对于免疫缺陷的人群危害更加明显。针对诺如病毒GⅡ.2和GⅡ.17,采用慢病毒包装系统,开发了含有ORF2 RNA的假病毒核酸标准物质。建立并优化基于逆转录-数字PCR技术的定量检测方法。2种标准物质具有较好的均匀性和稳定性,标准量值与扩展不确定度分别为(3.25±0.54)×10^(3) copies/μL,(3.33±0.74)×10^(3) copies/μL。标准物质可用于诺如病毒检测试剂盒的性能评价,提高检测结果的准确性与可比性。 展开更多
关键词 生物计量 诺如病毒 急性胃肠炎 逆转录-数字pcr 标准物质 定量检测
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紫苏种子中α-亚麻酸积累关键基因的筛选及克隆
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作者 耿鑫鑫 周讯 +4 位作者 杨凤琳 王力军 王颖 郭平安 陈亮 《湖北师范大学学报(自然科学版)》 2025年第2期69-77,共9页
为深入研究α-亚麻酸积累过程中的关键基因,以高α-亚麻酸含量紫苏品种43号为研究对象,选取油脂合成相关的6个关键酶基因,以茎为对照,利用qRT-PCR技术筛选在种子不同发育时期的表达量显著增高的关键基因。对筛选的关键基因进行生物信息... 为深入研究α-亚麻酸积累过程中的关键基因,以高α-亚麻酸含量紫苏品种43号为研究对象,选取油脂合成相关的6个关键酶基因,以茎为对照,利用qRT-PCR技术筛选在种子不同发育时期的表达量显著增高的关键基因。对筛选的关键基因进行生物信息学分析,并在紫苏中进行克隆。研究结果明确了候选基因PfFAD 3和PfFAD7基因是参与紫苏种子中α-亚麻酸积累的关键基因,并解析了PfFAD3和PfFAD7氨基酸及蛋白结构及与亲缘物种间的进化关系,为后续研究奠定了一定的基础。 展开更多
关键词 紫苏 Α-亚麻酸 候选基因 荧光定量pcr
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慢病毒载体CV2117-HAV-HTLV2假病毒的构建及其应用
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作者 房吉庆 魏夏杰 +4 位作者 袁子维 王瑶 李瑶玲 杨英 饶春明 《药物分析杂志》 北大核心 2025年第7期1101-1111,共11页
目的:构建含多个RNA病毒(CV2117、HAV和HTLV-2)基因的慢病毒载体假病毒,用于生物制品中外源RNA病毒PCR检测的阳性对照。方法:选用三质粒慢病毒包装体系,即包膜质粒(pMD2.G)、包装质粒(psPAX2)和穿梭质粒(pWPXL-EGFP),合成含多个目的基... 目的:构建含多个RNA病毒(CV2117、HAV和HTLV-2)基因的慢病毒载体假病毒,用于生物制品中外源RNA病毒PCR检测的阳性对照。方法:选用三质粒慢病毒包装体系,即包膜质粒(pMD2.G)、包装质粒(psPAX2)和穿梭质粒(pWPXL-EGFP),合成含多个目的基因片段的穿梭载体,pWPXLCV2117-HAV-HTLV-2-EGFP(pCHH-EGFP质粒),包膜质粒-包装质粒-穿梭质粒按照1∶3∶4转染HEK293T/17细胞包装假病毒,5 h后更换新鲜DMEM完全培养基,培养24 h后加入核酸酶酶解残余质粒DNA,收获转染后48 h和72 h病毒上清液;将病毒上清10倍稀释后加入到HEK293T/17细胞中,感染24 h后更换新鲜培养基,继续培养48 h,荧光显微镜观察病毒感染情况,流式细胞术检测病毒感染滴度,逆转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测假病毒目的基因拷贝数,具体步骤包括(1)预处理(42℃2 min)、(2)反转录(25℃5 min,1个循环;42℃30 min,1个循环;85℃5 min,1个循环)、(3)PCR扩增(37℃2 min,1个循环;95℃预变性10 min,1个循环;95℃变性15 s,60℃退火1 min,40个循环);获得的假病毒采用人间充质干细胞样品进行样品适用性验证。结果:三质粒慢病毒包装体系转染HEK293T/17细胞的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)阳性率>90%;PCR方法检测假病毒在核酸酶处理后,质粒DNA残留<0.005%;经流式细胞术检测慢病毒感染滴度,表达EGFP阳性细胞数占比为8.06%,病毒感染滴度为6.21×10^(5)TU·m L^(-1);RT-q PCR方法检测目的基因CV2117-1、CV2117-2、HAV-1、HAV-2、HTLV-2-1、HTLV-2-2拷贝数分别为2.99×10^(4)、1.50×10^(4)、2.40×10^(4)、1.09×10^(4)、2.03×10^(4)、1.92×10^(4)copies·μL^(-1)。样品适用性结果显示,慢病毒载体(lentivirus vector,LV)CV2117-HAV-HTLV2(LV-CHH)假病毒可用于间充质干细胞检测的阳性对照,适用性样品回收率为70%~130%。结论:成功构建含多个RNA病毒基因片段的LV-CHH假病毒,经验证可用于干细胞产品等的外源病毒PCR方法检测的阳性对照。 展开更多
关键词 慢病毒载体 假病毒 逆转录-实时荧光定量pcr 干细胞 外源病毒检测 流式细胞术
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乳及乳制品中β-酪蛋白检测研究进展
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作者 刘雯 陈志云 岳婷婷 《中外食品工业》 2025年第11期40-42,共3页
牛奶作为人们日常消费的商品,其营养价值十分丰富。β-酪蛋白作为牛奶中的重要组成成分,具有多种生理功能,与机体胃肠道健康、消化系统疾病等密切相关,在国内外广受关注。随着“A2奶”的广泛流行,针对β-酪蛋白的研究也越来越多。文章从... 牛奶作为人们日常消费的商品,其营养价值十分丰富。β-酪蛋白作为牛奶中的重要组成成分,具有多种生理功能,与机体胃肠道健康、消化系统疾病等密切相关,在国内外广受关注。随着“A2奶”的广泛流行,针对β-酪蛋白的研究也越来越多。文章从“A2奶”发展现状、酪蛋白概述、β-酪蛋白检测方法等方面介绍了A2 β-酪蛋白研究进展。在β-酪蛋白检测方法方面,随着科技发展,从早期的理化法、凯氏定氮法,到如今的基因检测法(含PCR-RFLP、AS-PCR、TaqMan探针法、rhAmp技术、HRM分析法)、电泳法(含毛细管电泳法、酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法)、色谱法(含高效液相色谱法、质谱法)以及红外光谱法等多种方法广泛应用,各有优缺点。 展开更多
关键词 Β-酪蛋白 pcr 电泳法 色谱法 光谱法
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地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)已配制扩增试剂的保存稳定性验证
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作者 张鑫 《实验室检测》 2025年第9期99-102,共4页
目的验证厦门至善科技股份有限公司研制的地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)已配扩增试剂保存稳定性,指导实验室正确使用及保存已配制扩增试剂。方法留取已报告的缺失型α-地中海贫血样本、β-地中海贫血样本、非缺失型α-... 目的验证厦门至善科技股份有限公司研制的地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)已配扩增试剂保存稳定性,指导实验室正确使用及保存已配制扩增试剂。方法留取已报告的缺失型α-地中海贫血样本、β-地中海贫血样本、非缺失型α-地中海贫血样本各3管,阴性样本2管。将厦门至善生物科技股份有限公司研制的地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)按照试剂盒要求配制扩增试剂,并分装至八联管内,编号1、2、3、4、5,将1号管内试剂暂存2~8℃冰箱内,2、3、4、5管试剂暂存-20℃冰箱内,于试剂配制日期后的12 h、1 d、3 d、5 d、7 d分别对留取样本进行检测,记录分析结果。结果α-地中海贫血样本、β-地中海贫血样本、缺失型α-地中海贫血样本及阴性样本在使用编号1、2、3、4、5管扩增试剂进行检测后的结果与留样结果一致。结论厦门至善科技股份有限公司研制的地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)已配制扩增试剂于-20℃暂存一周、2~8℃暂存12 h,对样本检测结果无影响。 展开更多
关键词 缺失型Α-地中海贫血 Β-地中海贫血 非缺失型α-地中海贫血 荧光pcr 熔解曲线法 稳定性验证 基因检测
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LncHCG11、miR-214-5p在胰腺癌中的表达水平及分子机制
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作者 彭文斌 尹媛媛 +1 位作者 唐玉玲 唐湘阳 《免疫学杂志》 2025年第6期417-423,共7页
目的探讨长链非编码RNA HCG11(LncHCG11)和miR-214-5p在胰腺癌组织中的表达水平及其潜在分子调控机制。方法纳入2022年1月至2025年1月收治的胰腺癌患者10例,采集术后癌组织及配对癌旁组织样本。采用实时定量PCR技术检测LncHCG11和miR-21... 目的探讨长链非编码RNA HCG11(LncHCG11)和miR-214-5p在胰腺癌组织中的表达水平及其潜在分子调控机制。方法纳入2022年1月至2025年1月收治的胰腺癌患者10例,采集术后癌组织及配对癌旁组织样本。采用实时定量PCR技术检测LncHCG11和miR-214-5p的转录水平,通过蛋白免疫印迹法测定沉默调节蛋白2(SIRT2)蛋白表达量,并通过生物数据库预测miR-214-5p与LncHCG11、SIRT2的关系。结果相较于癌旁组织,胰腺癌组织中LncHCG11及SIRT2表达显著降低,而miR-214-5p水平显著升高(P<0.01)。体外实验显示,在panc1细胞系中过表达LncHCG11可上调SIRT2蛋白表达,同时抑制panc1细胞增殖活性(P<0.05)。miR-214-5p和LncHCG11、SIRT2均存在结合位点。结论LncHCG11可能作为竞争性内源RNA吸附miR-214-5p,解除其对SIRT2的转录抑制,从而抑制胰腺癌的进展。 展开更多
关键词 LncHCG11 miR-214-5p 沉默调解蛋白2 胰腺肿瘤 panc1细胞系 细胞增殖 实时定量pcr
原文传递
犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:24
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作者 乔军 孟庆龄 +2 位作者 夏咸柱 何宏彬 范泉水 《西南农业学报》 CSCD 2002年第1期93-95,共3页
用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试... 用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。 展开更多
关键词 犬瘟热 犬冠状病毒 RT-pcr检测 应用 特异性引物 核酸 敏感性 CCV模板 电镜负染 兽医临床
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多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因 被引量:27
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作者 于力 朱龙英 +3 位作者 万延慧 杨少军 朱为民 薛林宝 《分子植物育种》 CAS CSCD 2008年第1期165-169,共5页
利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物... 利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398bp、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。与Mi基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生750bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570bp和180bp以及750bp、570bp和180bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。酶切结果仍为750bp的产物。经反复验证,结果准确可靠,可以用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。 展开更多
关键词 番茄 Ty-1 MI 多重pcr 分子标记
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利用多重PCR反应同时筛选番茄Cf-9和Tm-1基因 被引量:9
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作者 宋燕 陈丽静 +4 位作者 李君明 张智 李天来 徐和金 周永健 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 2006年第2期165-169,共5页
利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的... 利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗叶霉病的Cf-9基因和抗番茄烟草花叶病毒病的Tm-1基因紧密连锁的PCR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Cf-9基因紧密连锁的CAPs标记在抗感试材均可扩增出560bp的特异片段,且都存在TaqI酶切位点,抗病基因型酶切后分别产生了450bp、330bp和290bp的不同特异性片段,而感病基因型试材酶切后产生450bp和290bp的特异性片段;与Tm-1基因紧密连锁的SCAR标记为显性标记,只有抗病试材产生750bp的特异片段,不能被TaqI酶切。经反复验证,结果稳定准确,可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。该体系的建立不仅省时、省工、节省费用,而且可用于苗期辅助选育,加快番茄抗病育种进程。 展开更多
关键词 番茄 多重pcr反应 叶霉病 番茄烟草花叶病毒病
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