目的构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2,hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基...目的构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2,hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再反转录成cDNA,扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞,通过碱性磷酸酶(AP)、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1.2 kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA(pHIV-hBMP2);③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后,碱性磷酸酶分泌增加,钙沉积增加,Ⅰ型胶原蛋白表达增加,成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化,为组织工程研究提供良好的种子细胞。展开更多
文摘目的构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2,hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再反转录成cDNA,扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞,通过碱性磷酸酶(AP)、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1.2 kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA(pHIV-hBMP2);③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后,碱性磷酸酶分泌增加,钙沉积增加,Ⅰ型胶原蛋白表达增加,成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化,为组织工程研究提供良好的种子细胞。
