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CRISPR/Cas9结合loxP-Cre技术制备肝特异性G6PC基因缺陷小鼠的实验研究 被引量：1
1
作者 王薇 宋红梅 +3 位作者 张胜海 刘铭 张长青 邱正庆 《北京医学》 CAS 2020年第11期1127-1131,共5页
目的建立肝特异性G6PC基因纯合缺陷的Ia型糖原累积症(glycogen storage disease Ia,GSD Ia)小鼠模型。方法通过CRISPR/Cas9基因重组技术使C57BL/6J小鼠受精卵中G6PC基因外显子2两侧分别插入1个loxP原件,产仔后经鉴定打靶成功的小鼠通过... 目的建立肝特异性G6PC基因纯合缺陷的Ia型糖原累积症(glycogen storage disease Ia,GSD Ia)小鼠模型。方法通过CRISPR/Cas9基因重组技术使C57BL/6J小鼠受精卵中G6PC基因外显子2两侧分别插入1个loxP原件,产仔后经鉴定打靶成功的小鼠通过扩繁、兄妹交配及与Alb-Cre小鼠交配,最终产生G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表达的肝特异性G6PC基因2号外显子纯合敲除的GSD Ia小鼠模型。通过监测模型鼠及背景鼠的餐后0~12 h的血糖来验证模型是否成功。结果经PCR鉴定F0及F1代小鼠成功于G6PC基因2号外显子两侧插入loxP原件并可稳定遗传;最终成功建立G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表达的GSD Ia小鼠,检测餐后1~12 h血糖均低于背景鼠,说明造模成功。结论应用CRISPR/Cas9基因重组技术及loxP-Cre系统可建立肝特异性G6PC基因缺陷的GSD Ia小鼠,可用于该病的病理研究及药物研发。 展开更多
关键词 糖原累积症Ia型 肝特异性G6PC基因敲除 小鼠模型 CRISPR/Cas9 loxp-cre
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基于Loxp-Cre系统的去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠模型的构建 被引量：1
2
作者 秦书霞 刘雯 张令强 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期721-726,共6页
目的应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠。方法利用Loxp-Cre系统原理,将Otud4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再... 目的应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠。方法利用Loxp-Cre系统原理,将Otud4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配繁育,最终得到杂合子小鼠并进行自交得到新生F1代小鼠。然后利用PCR进行基因型鉴定,使用免疫印迹(WB)技术从蛋白水平检测OTUD4在各组织器官中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。对各基因型小鼠进行数量统计分析明确其是否符合孟德尔遗传定律,是否具有胚胎致死表型。解剖小鼠观察主要组织器官有无明显发育异常,利用HE染色观察是否具有自发的病理改变。通过葡萄糖耐受实验分析基因敲除小鼠是否具有代谢异常等。结果基因型鉴定和WB检测结果显示Otud4基因敲除小鼠模型成功建立。杂合子小鼠自交后各基因型比例符合孟德尔定律,提示Otud4基因敲除小鼠非胚胎致死。各组织器官大小无显著性差异,HE染色并无异常,且Otud4基因敲除后不影响小鼠的血糖稳态。结论应用Loxp-Cre系统成功构建了Otud4基因敲除小鼠,且小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷,各器官无显著病理性变化,血糖代谢无异常。 展开更多
关键词 泛素 loxp-cre OTUD4 小鼠 基因敲除 聚合酶链反应 基因型
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Col1^(+)细胞在牙槽窝愈合中的时空分布及分化潜能
3
作者 赵昱 昝冰欣 +5 位作者 孙思远 黄湘如 高洁 吴轶群 江凌勇 代庆刚 《上海交通大学学报(医学版)》 北大核心 2026年第2期143-150,共8页
目的·将Cre/loxP重组酶系统与拔牙模型相结合,探究分泌Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COL1)的Col1^(+)细胞在牙槽窝愈合过程中的时空分布规律及其向成骨细胞的分化潜能。方法·将Col1-CreERT2小鼠与Rosa26-LoxP-Stop-LoxPtdTom... 目的·将Cre/loxP重组酶系统与拔牙模型相结合,探究分泌Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COL1)的Col1^(+)细胞在牙槽窝愈合过程中的时空分布规律及其向成骨细胞的分化潜能。方法·将Col1-CreERT2小鼠与Rosa26-LoxP-Stop-LoxPtdTomato小鼠交配繁殖,以获得Col1-CreERT2;tdTomato双转基因子代小鼠。取15只子代小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA)标记Col1^(+)细胞谱系,1周后于全身麻醉下完整拔除子代小鼠右侧上颌第一磨牙,以构建双转基因小鼠拔牙模型。将子代小鼠分为5组(每组3只),分别在0、3、7、14、28 d取小鼠上颌骨样本,通过石蜡切片观察Col1^(+)细胞谱系在牙槽窝愈合过程中的动态分布;利用免疫荧光技术标记成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、血管标志物内皮黏蛋白(endomucin,EMCN)、神经元标志物β3微管蛋白(β3-tubulin)探究Col1^(+)细胞的成骨潜能及其与血管、神经的空间定位关系。结果·成功构建了Col1-CreERT2;tdTomato双转基因小鼠拔牙模型。石蜡切片观察的结果显示:建模后第3日,牙槽窝中出现Col1^(+)细胞;第7日,Col1^(+)细胞的数量增加,牙槽窝逐渐成骨;第28日,Col1^(+)细胞的比例进一步上升,且分布于骨小梁周围。统计结果显示,Col1^(+)细胞数量在牙槽窝愈合过程中随时间的推移而增加(与第0日相比,均P<0.001)。免疫荧光技术检测的结果显示,建模后第7~28日,牙槽窝内Col1^(+)OSX+双阳性细胞数量逐渐增多,Col1^(+)细胞在空间定位上分别与EMCN和β3-tubulin相邻。结论·在牙槽窝愈合过程中,Col1^(+)细胞具有向成骨细胞分化的潜能,还可能参与血管、神经生成。 展开更多
关键词 谱系示踪技术 Ⅰ型胶原蛋白 Cre/loxP重组酶系统 牙槽窝愈合
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肾小管上皮细胞特异性FXR敲除小鼠模型建立及功能初探
4
作者 刘兆丰 李玲 +2 位作者 那淑芳 乐江 叶啟发 《中国临床药理学与治疗学》 北大核心 2025年第11期1508-1515,共8页
目的:探讨肾小管上皮细胞特异性法尼酯X受体(FXR)基因敲除对小鼠肾功能的影响。方法:基于cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞特异性FXR基因敲除小鼠。采用qRT-PCR检测肾脏FXR的mRNA水平,Western blot和免疫荧光法检测肾脏FXR的蛋白表达,苏... 目的:探讨肾小管上皮细胞特异性法尼酯X受体(FXR)基因敲除对小鼠肾功能的影响。方法:基于cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞特异性FXR基因敲除小鼠。采用qRT-PCR检测肾脏FXR的mRNA水平,Western blot和免疫荧光法检测肾脏FXR的蛋白表达,苏木精-伊红染色、过碘酸雪夫染色观察小鼠肾脏形态,透射电子显微镜观察超微结构下肾小管形态。试剂盒检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和尿β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl glucosaminidase,NAG)水平评估肾功能。结果:肾小管上皮细胞特异性FXR敲除小鼠肾脏FXR的mRNA水平、蛋白表达水平降低,肾小管可见空泡化,血清中SCr、BUN水平未见明显改变,但尿液中NAG水平显著升高。结论:肾小管上皮细胞特异性FXR基因敲除小鼠模型建立成功,FXR敲除导致肾小管上皮细胞空泡化和肾功能降低。 展开更多
关键词 cre-loxp系统 法尼酯X受体 肾小管上皮 空泡化 肾功能
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NK细胞条件性Cd226基因敲除小鼠的构建及其在溃疡性结肠炎中作用的初步研究
5
作者 吕建春 郭紫婵 +3 位作者 王亚珍 陈子嫣 张正祥 陈丽华 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第6期488-494,共7页
目的采用Cre-loxP技术构建并鉴定自然杀伤(NK)细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,进一步探索NK细胞表面CD226分子在缓解溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道炎症中的作用。方法通过loxP标记的转基因小鼠以及天然细胞毒性受体1(Ncr1)-Cre工具鼠,依靠Cre-... 目的采用Cre-loxP技术构建并鉴定自然杀伤(NK)细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,进一步探索NK细胞表面CD226分子在缓解溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠道炎症中的作用。方法通过loxP标记的转基因小鼠以及天然细胞毒性受体1(Ncr1)-Cre工具鼠,依靠Cre-loxP系统构建NK细胞条件性Cd226基因敲除小鼠模型;采用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术对小鼠基因型进行鉴定,用葡聚糖硫酸钠诱导构建Cd226基因敲除小鼠UC模型;流式细胞术检测NK细胞上CD226的表达水平以及相关免疫细胞在结肠组织的浸润水平;HE染色验证结肠组织炎症水平。结果DNA凝胶电泳技术和流式细胞术证实NK细胞条件性Cd226基因敲除小鼠成功构建,NK细胞条件性敲除Cd226基因后,UC小鼠模型炎症状况缓解,流式细胞术结果显示外周血和结肠固有层中NK细胞比例降低,HE染色结果显示肠道炎症反应减轻。结论NK细胞特异性敲除Cd226通过减少NK细胞数量及抑制其促炎功能缓解小鼠UC模型肠道炎症。 展开更多
关键词 CRE-LOXP CD226 NK细胞 基因敲除小鼠
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CSF1R^(+/-)小鼠的构建和基因鉴定
6
作者 周园园 刘崇 +4 位作者 王安琪 张慧茹 邱佳琪 朱梦娟 涂佳杰 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第5期884-889,共6页
目的构建集落刺激因子1受体杂合(CSF1R^(+/-))小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点提供动物模型基础。方法根据Cre/Loxp系统设计一种线性化的靶向载体,在集落刺激因子1受体(CSF1R)基因第5外显子上游插入一个Loxp位点,在第5外... 目的构建集落刺激因子1受体杂合(CSF1R^(+/-))小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点提供动物模型基础。方法根据Cre/Loxp系统设计一种线性化的靶向载体,在集落刺激因子1受体(CSF1R)基因第5外显子上游插入一个Loxp位点,在第5外显子下游插入一个双侧有Loxp位点的新霉素抗性盒(PGK-neo)。将线性化的靶向载体电穿孔至胚胎干细胞(ES)。将正确靶向的ES注射到C57BL/6J小鼠的胚泡中得到嵌合小鼠,与透明带3-Cre(Zp3-Cre)小鼠进行繁殖。新生小鼠出生后9~14天编号并剪鼠尾,提取小鼠的DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出CSF1R^(+/-)小鼠。应用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞中CSF1R的表达;Western blot检测小鼠组织中CSF1R的蛋白表达。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,野生小鼠(WT)扩增出453 bp的条带,CSF1R^(+/-)小鼠扩增出453 bp和650 bp的条带。流式细胞术结果显示,与WT组比较,CSF1R^(+/-)组小鼠的腹腔来源巨噬细胞(PM)和骨髓来源巨噬细胞(BMDM)中的CSF1R低表达(P<0.05)。Western blot结果显示,与WT组比较,CSF1R^(+/-)组小鼠脾脏、肾脏、脑组织中的CSF1R蛋白低表达(P<0.05)。结论成功构建、繁育和鉴定CSF1R^(+/-)小鼠,为进一步揭示CSF1R在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础。 展开更多
关键词 CSF1R PCR Western blot 流式细胞术 Cre/Loxp 动物模型
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基于Cre/loxP系统构建酿酒酵母YVC1基因缺失菌株
7
作者 王晶晶 董晓宇 《生物学杂志》 北大核心 2025年第5期60-66,共7页
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡膜上的钙离子通道Yvc1是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一,Ca2+作为第二信使,可以提高酿酒酵母生产乙醇能力。因此,构建YVC1基因缺失菌株,为后期钙通道功能研究奠定基础。通过PCR技术,验证酿酒... 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡膜上的钙离子通道Yvc1是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一,Ca2+作为第二信使,可以提高酿酒酵母生产乙醇能力。因此,构建YVC1基因缺失菌株,为后期钙通道功能研究奠定基础。通过PCR技术,验证酿酒酵母DL5168中YVC1基因的存在。通过齐-尼二氏染色法和基因组特异性PCR,鉴定DL5168菌株染色体倍性。基于Cre/loxP系统原理,构建YVC1基因敲除组件,并通过醋酸锂转化法将其转至DL5168菌株中,通过含有100μg/mL G418的YPD培养基筛选出阳性重组子。将pSH65质粒转入阳性重组子,用于切除抗性基因KanMX。结果表明,酿酒酵母DL5168基因组中具有液泡电导1基因YVC1。DL5168菌株为aα型二倍体。敲除组件pUG6-YVC1-loxP-KanMX成功与DL5168菌株发生同源重组,筛选到阳性重组子。pSH65质粒在半乳糖的诱导下产生Cre重组酶,成功切除重组子中的抗性基因KanMX,获得YVC1一条等位基因缺失菌株DL5168-yvc1Δ。相同方法敲除另一条同源染色体上的等位基因。最终研究成功获得YVC1基因双倍体缺失菌株DL5168-yvc1Δ/Δ。 展开更多
关键词 酿酒酵母 YVC1基因 CRE/LOXP系统 基因敲除 等位基因
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基于Cre-Loxp系统构建特异性标记血管内皮细胞的双荧光大鼠模型
8
作者 姚宇晴 薛子卓 +6 位作者 张燕欣 李德坤 万梅绪 李智 原景 聂永伟 鞠爱春 《实验动物科学》 2025年第2期71-75,共5页
目的旨在利用Cre-Loxp系统构建特异性标记血管内皮细胞的双荧光大鼠模型,以便研究血管内皮细胞的结构和功能。方法将使用Cre重组酶与血管内皮细胞特异性启动子相连构建的Tek-e(Cre)3基因,定点敲入大鼠与Rosa26定点CAG-Loxp-tdTomato-3xp... 目的旨在利用Cre-Loxp系统构建特异性标记血管内皮细胞的双荧光大鼠模型,以便研究血管内皮细胞的结构和功能。方法将使用Cre重组酶与血管内皮细胞特异性启动子相连构建的Tek-e(Cre)3基因,定点敲入大鼠与Rosa26定点CAG-Loxp-tdTomato-3xpolyA-Loxp-EGFP-WPRE-polyA基因表达大鼠,分别进行鉴定和杂交,对其产生的子代大鼠进行基因型鉴定,并取子代大鼠的脑和心脏组织制成冰冻切片后,使用荧光显微镜观察其表型特征。结果两种亲代大鼠基因型鉴定结果显示亲代大鼠均为纯合子,对子代大鼠进行基因型鉴定结果显示两种基因都在子代大鼠中表达且子代大鼠为纯合子。在荧光显微镜下观察到大鼠脑和心脏组织中血管部位存在着绿色荧光(EGFP)信号,而其他组织则表现出红色荧光(tdTomato)信号,指示Cre-Loxp系统成功地使EGFP基因在血管内皮细胞中表达。结论本研究构建的双荧光大鼠模型成功地实现了对血管内皮细胞的特异标记,该模型的构建为研究血管内皮细胞的结构、功能和相关疾病提供了有力的工具。 展开更多
关键词 大鼠 Cre-Loxp系统 荧光蛋白 血管内皮细胞
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血管内皮细胞特异性Traf2基因敲除小鼠的制备及鉴定
9
作者 陈卓 蒯佳婕 +2 位作者 王凤玲 何菊 魏伟 《中国药理学通报》 北大核心 2025年第8期1592-1598,共7页
目的构建血管内皮细胞(endothelial cell,EC)特异性肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,Traf2)基因敲除小鼠,为研究通过TRAF2调控血管EC活性致血管功能障碍相关疾病提供实验动物模型。方法C... 目的构建血管内皮细胞(endothelial cell,EC)特异性肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,Traf2)基因敲除小鼠,为研究通过TRAF2调控血管EC活性致血管功能障碍相关疾病提供实验动物模型。方法Cre-loxP系统构建血管EC特异性Traf2基因敲除(Traf2^(flox/flox)Tek-iCre^(+))小鼠;PCR和凝胶电泳鉴定小鼠基因型;流式分离小鼠血管原代EC;Western blot和免疫荧光验证小鼠血管EC中Traf2敲除效果;HE染色检测小鼠血管及主要器官病理形态改变;基质胶成管检测小鼠血管原代EC成管能力。结果敲除小鼠基因型符合要求;流式结果表明,成功分选出血管原代EC,敲除小鼠血管EC中TRAF2表达降低(P<0.01);组织学结果显示,敲除小鼠血管TRAF2表达降低,血管及主要器官形态无明显改变。基质胶成管表明模型小鼠血管原代EC成管能力下降。结论成功构建血管EC特异性Traf2基因敲除小鼠,可为研究血管功能障碍相关疾病中TRAF2对血管EC的调控机制提供可靠的动物模型。 展开更多
关键词 血管内皮细胞 TRAF2 特异性基因敲除 胸主动脉血管 CRE-LOXP 血管功能障碍
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巨噬细胞特异性胶原β(1-O)半乳糖基转移酶1基因敲除小鼠模型的构建与鉴定
10
作者 仇培培 孙晓娇 +4 位作者 王蕾 王祉祺 衣楚潇 刘振明 张继国 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第8期1214-1222,共9页
Colgalt1异常表达与肿瘤发生、发展密切相关,但其调控巨噬细胞影响肿瘤发展的机制尚不明确。本研究旨在构建巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠模型,以深入探究Colgalt1调控巨噬细胞功能进而影响肿瘤相关疾病发生和发展的机制。首先,... Colgalt1异常表达与肿瘤发生、发展密切相关,但其调控巨噬细胞影响肿瘤发展的机制尚不明确。本研究旨在构建巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠模型,以深入探究Colgalt1调控巨噬细胞功能进而影响肿瘤相关疾病发生和发展的机制。首先,利用基因编辑构建了Colgalt1^(flox+)小鼠,随后将其与髓细胞系(包括单核细胞、成熟巨噬细胞)组织特异性表达的Lyz2-Cre^(+)小鼠进行杂交。通过这一策略,成功获得基因型为Colgalt1^(-/-)Lyz2-Cre^(+)的小鼠,实现了巨噬细胞中Colgalt 1基因的条件性敲除,以Colgalt1 flox/flox Lyz2-Cre^(-)小鼠作为对照组。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对敲除小鼠的Flox及Cre基因型进行鉴定。采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术,检测敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞中Colgalt1的表达水平。Western印迹结果显示,与对照组相比,敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中Colgalt1的表达水平显著下调(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与对照组相比,敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中Colgalt 1在mRNA水平显著下调(P<0.001),而在小鼠的肝、肺和脾等组织中,Colgalt 1基因的mRNA表达无明显差异。此外,采用免疫组织化学方法检测肝内特异性巨噬细胞中Colgalt1的表达,结果显示,在敲除小鼠肝的巨噬细胞中未观察到Colgalt1阳性表达。通过苏木精-伊红染色观察2组小鼠肝组织内细胞形态,结果显示,2组小鼠肝组织内细胞形态无明显差异,且组织器官未发现明显病变,小鼠整体生存亦未受到影响,最后,通过RT-qPCR检测了巨噬细胞相关炎性因子在2组小鼠BMDMs中的表达,结果表明,与对照组相比,敲除组小鼠BMDMs中TNF-α表达显著下调(P<0.05),而IL-10(P<0.01)、精氨酸酶1(arginase1)(P<0.001)和CD206(P<0.001)表达显著上调,表明巨噬细胞敲除Colgalt 1后呈现抗炎趋势并向M2极化。综上所述,本研究成功构建了巨噬细胞特异性Colgalt 1基因敲除小鼠,为深入探究Colgalt1在巨噬细胞功能调控以及肿瘤疾病发生机制中的具体作用,提供了更为可靠的实验动物模型,有望为肿瘤等疾病的治疗提供新的靶点和思路。 展开更多
关键词 胶原β(1-O)半乳糖基转移酶1 条件性基因敲除 巨噬细胞 Cre-LoxP重组酶系统 动物模型
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滑膜细胞条件性敲除Grk2基因小鼠的构建和鉴定
11
作者 左书俊 王伟康 +4 位作者 谷金涛 郭富媛 郭昊周 韩陈陈 魏伟 《中国药理学通报》 北大核心 2025年第6期1194-1199,共6页
目的构建滑膜细胞条件性敲除G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因小鼠并分析基因型,为研究GRK2在滑膜细胞中的功能提供动物模型。方法将Grk2^(flox/+)小鼠交配得到Grk2^(flox/flox)小鼠,Grk2^(flox/flox)... 目的构建滑膜细胞条件性敲除G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因小鼠并分析基因型,为研究GRK2在滑膜细胞中的功能提供动物模型。方法将Grk2^(flox/+)小鼠交配得到Grk2^(flox/flox)小鼠,Grk2^(flox/flox)和Col1a1-iCre^(+)小鼠交配,获得Grk2^(flox/+)Col1a1-iCre^(+)与Grk2^(flox/flox)小鼠交配,得到Grk2^(flox/flox) Col1a1-iCre^(+)为目的小鼠。提取DNA,PCR扩增,鉴定基因型;Western blot验证滑膜、肝脏和肾脏组织GRK2敲除效果;HE染色检测滑膜细胞条件性敲除Grk2对踝关节滑膜、肝脏和肾脏组织的影响;多重免疫荧光检测滑膜细胞GRK2表达。结果基因鉴定结果表明,Grk2^(flox/flox) Col1a1-iCre^(+)小鼠Flox和Col1a1-iCre基因型均符合要求;Western blot结果表明,Grk2^(flox/flox) Col1a1-iCre^(+)小鼠滑膜组织GRK2表达降低,肝脏和肾脏组织GRK2表达无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(flox/flox) Col1a1-iCre^(+)小鼠踝关节滑膜、肝脏和肾脏组织病理无明显改变;多重免疫荧光结果表明,Grk2^(flox/flox) Col1a1-iCre^(+)小鼠滑膜细胞GRK2表达降低。结论成功构建和鉴定滑膜细胞条件性敲除Grk2基因小鼠,为进一步研究GRK2在滑膜细胞相关疾病中的作用提供动物模型。 展开更多
关键词 G蛋白偶联受体激酶2 滑膜组织 滑膜细胞 Cre-loxP系统 CRISPR/Cas9 条件性敲除小鼠
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用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定 被引量：6
12
作者 王琰 王欲晓 +2 位作者 陈晓穗 化冰 刘晓琳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期93-96,共4页
目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体。方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库。通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载... 目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体。方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库。通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体。结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL。经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组。结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库。 展开更多
关键词 噬茵体抗体库 容量 表达载体 p3MH PAL loxp-cre定位重组系统
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基于食管上皮Trp53敲除和Ccnd1过表达的食管癌自发成瘤小鼠模型的构建
13
作者 张秀森 张旭东 +5 位作者 金星 张石垒 郭笑希 陈世昱 原翔 高社干 《食管疾病》 2025年第4期241-247,266,共8页
目的利用Cre-loxP系统和CRISPR/Cas9技术构建Trp53基因敲除和Ccnd1过表达的小鼠食管癌模型。方法针对C57BL/6小鼠Trp53基因外显子2-9,设计RNA靶位点并在体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代小鼠,... 目的利用Cre-loxP系统和CRISPR/Cas9技术构建Trp53基因敲除和Ccnd1过表达的小鼠食管癌模型。方法针对C57BL/6小鼠Trp53基因外显子2-9,设计RNA靶位点并在体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代小鼠,繁育得到Trp53fl/fl小鼠。同时针对C57BL/6小鼠基于Cre-loxP系统在其安全位点设计鼠Ccnd1基因条件性过表达(Ccnd1R26-LSL-mcherry)小鼠。用Trp53fl/fl小鼠、Ccnd1R26-LSL-mcherry小鼠和带有EDL2-Cre小鼠进行交配繁殖,收集小鼠尾部组织提取DNA,利用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳对其子代进行基因型鉴定,验证基因在小鼠的表达情况,得到目标小鼠,即食管上皮Trp53基因敲除Ccnd1过表达小鼠(Trp53fl/fl;Ccnd1R26-LSL-mcherry;EDL2-Cre小鼠,简写为Trp53fl/fl;Ccnd1cKI/cKI;EDL2-Cre鼠),并命名为CP鼠。提取CP小鼠食管组织蛋白,用Western blot检测Trp53蛋白和Ccnd1蛋白的表达水平;记录CP小鼠的体重,并与野生型小鼠比较;取不同生长时期的小鼠,行苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠食管组织的形态结构。结果根据鼠尾提取的DNA用PCR技术能鉴定出小鼠的基因型,成功繁育出CP小鼠,该小鼠可正常生长,体质量与野生型小鼠无明显差异(P>0.05),状态良好,饮食饮水正常。根据小鼠食管切片HE染色统计结果显示,在12月龄,食管癌发生率可达28%,可用于后期研究。结论成功构建的CP鼠可在正常生长过程中出现食管上皮特异性癌变,将为探索食管癌的生理病理作用机制及免疫微环境对肿瘤的影响提供在体模型。 展开更多
关键词 食管癌 Cre-loxP系统 CRISPR/Cas9技术 小鼠模型
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基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠
14
作者 杨坤 章容 +4 位作者 吴越 雷小平 谌云川 康兰 董文斌 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第14期2943-2950,共8页
背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP... 背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。 展开更多
关键词 SENP1 Cre-loxP重组酶系统 肺泡Ⅱ型上皮细胞 条件性基因敲除 小鼠
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Tmem121肝细胞特异性敲除小鼠模型的建立与鉴定
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作者 王月 何国良 +2 位作者 李兰玉 吴倩 周军媚 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第9期1591-1598,共8页
目的建立并鉴定跨膜蛋白121(Tmem121)肝细胞特异性基因敲除小鼠。方法利用CRISPR/Cas9与Cre-loxp系统构建Tmem121^(flox/+)/Cre^(+)与Tmem121^(flox/flox)小鼠,再将两种小鼠进行杂交繁育获得后代小鼠。提取后代小鼠的鼠尾DNA,通过PCR鉴... 目的建立并鉴定跨膜蛋白121(Tmem121)肝细胞特异性基因敲除小鼠。方法利用CRISPR/Cas9与Cre-loxp系统构建Tmem121^(flox/+)/Cre^(+)与Tmem121^(flox/flox)小鼠,再将两种小鼠进行杂交繁育获得后代小鼠。提取后代小鼠的鼠尾DNA,通过PCR鉴定小鼠基因型,获得肝细胞特异性Tmem121基因敲除小鼠(Tmem121^(flox/flox)/Cre^(+),Tmem121^(ΔHep))。观察并分析敲除小鼠与对照小鼠的生长繁殖及器官发育情况。利用PCR及Western blot法验证Tmem121在小鼠原代肝细胞中敲除效率。利用CellMask^(TM)深红质膜染色法比较对照组小鼠与敲除组小鼠原代肝细胞的形态差异并进行统计学分析。结果通过小鼠基因型鉴定,成功获得Tmem121^(flox/flox)/Cre^(+)小鼠。敲除小鼠与对照小鼠在体质量、繁殖能力及肝脏的生长发育方面均无明显差异。肝细胞特异性敲除Tmem121基因对肝组织形态结构及病理特征无明显影响。与对照组相比,敲除组小鼠原代肝细胞Tmem121在mRNA及蛋白水平均明显降低(P<0.01)。CellMask^(TM)深红质膜染色结果显示Tmem121敲除组小鼠的原代肝细胞的双核比例增多(P<0.05),细胞表面积减小(P<0.001)。结论成功建立Tmem121肝细胞特异性基因敲除小鼠模型,为进一步研究Tmem121基因在肝脏疾病中的作用及机制提供了动物模型支持。 展开更多
关键词 跨膜蛋白121 特异性敲除 CRE/LOXP系统 肝细胞 基因型鉴定 原代肝细胞分离
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肝细胞特异性NLRP3基因敲除小鼠模型的构建及鉴定
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作者 苟鸿翔 韩金成 +3 位作者 甘丰德 易耀兴 范克瑞 胡凯 《局解手术学杂志》 2025年第11期950-954,共5页
目的探讨利用Cre-LoxP基因敲除技术构建肝特异性NLRP3基因敲除小鼠模型的可能性及基因鉴定方法。方法第一阶段将肝细胞特异性表达白蛋白启动子-Cre(AlbCre)重组酶的小鼠与NLRP3^(flox/flox)小鼠进行交配,经2代选育配种,获取基因型为NLRP... 目的探讨利用Cre-LoxP基因敲除技术构建肝特异性NLRP3基因敲除小鼠模型的可能性及基因鉴定方法。方法第一阶段将肝细胞特异性表达白蛋白启动子-Cre(AlbCre)重组酶的小鼠与NLRP3^(flox/flox)小鼠进行交配,经2代选育配种,获取基因型为NLRP3^(flox/flox)/Alb^(Cre+/-)的肝细胞特异性NLRP3基因敲除小鼠(肝细胞NLRP3敲除组)和基因型为NLRP3^(flox/flox)/Alb^(Cre-/-)的小鼠为同窝对照小鼠(同窝对照组)。第二阶段为大量繁殖阶段,将NLRP3^(flox/flox)/Alb^(Cre+/-)目的小鼠与NLRP3^(flox/flox)小鼠交配繁殖可快速获得大量实验用目的小鼠与同窝对照小鼠。小鼠编号后剪取鼠尾提取DNA,采用PCR法鉴定繁殖小鼠的基因表型;qPCR和Western blot检测小鼠肝组织中NLRP3 mRNA和蛋白表达水平,HE染色观察肝组织形态学改变,检测血清肝转氨酶、炎症因子。观察2组小鼠体质量变化、肝体比值及繁殖发育中的特殊情况。结果F2代中目的小鼠基因表型符合理论结果NLRP3^(flox/flox)/Alb^(Cre+/-);肝细胞NLRP3敲除组小鼠肝组织中NLRP3 mRNA及蛋白表达水平显著低于同窝对照组(P<0.05);肝细胞NLRP3敲除组小鼠NLRP3基因敲除后不影响生长发育及繁殖,小鼠体质量、肝体比值、肝组织形态、血清肝转氨酶、炎症因子与同窝对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论采用Cre-LoxP基因敲除技术可成功构建肝细胞特异性NLRP3基因敲除小鼠模型,为下一步动物层面研究肝中NLRP3基因功能提供了重要的技术支持。 展开更多
关键词 NLRP3 Cre-LoxP技术 肝 基因敲除 肝细胞
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Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价 被引量：10
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作者 王志蕊 刘西梅 +4 位作者 周荆荣 郑新民 魏庆信 董发明 毕延震 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期194-201,共8页
选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用... 选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP).经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系.将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选(FACS)、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1%,DNA水平的删除效率则达到97%.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据. 展开更多
关键词 CRE LOXP 安全转基因 选择标记 绿色荧光蛋白 删除
原文传递
利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除 被引量：9
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作者 薛可 李峰 +2 位作者 罗光彬 黄玮玮 陈学进 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期570-574,共5页
利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛β酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的同源臂,成功地敲除了β酪蛋白基因... 利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛β酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体,设计不同的同源臂,成功地敲除了β酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列,插入新的基因,研究其表达功能,或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 同源重组 牛β酪蛋白基因 Cre-loxP重组系统 基因敲除
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血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立(英文) 被引量：3
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作者 李文龙 程萱 +4 位作者 谭晓红 张继帅 孙岩松 陈林 杨晓 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第9期909-915,共7页
血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细... 血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。经基因组PCR和SouthernBlot鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Cre基因,整合率为11%。为了验证Cre重组酶的剪切活性和表达组织分布,我们将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和报告小鼠ROSA26交配。Tie2-Cre;Smad4Co/+小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示,Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎LacZ染色结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。因此,Tie2-Cre转基因小鼠可作血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。 展开更多
关键词 TIE2 血管内皮细胞 CRE-LOXP 转基因小鼠 CRE重组酶 特异表达 基因组DNA CRE-LOXP Southern 组织分布
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一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究(英文) 被引量：2
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作者 崔文涛 任立明 +3 位作者 侯健 张颖 陈永福 安晓荣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第6期650-660,共11页
Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究... Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究.首先构建了两个载体:a.整合载体pTE-lox2272-DsRed-loxP-GFP-loxP,含有红色荧光标记基因DsRed和绿色荧光标记基因GFP;b.置换载体pT-lox2272-neo-loxP,含有筛选标记基因neo,用以置换DsRed基因.然后,用整合载体转染SHZ-88细胞,并随机挑取了3个同时表达DsRed和GFP的稳定整合细胞克隆.随后用置换载体和Cre表达载体PBS185对以上每个克隆分别进行了3次共转染,通过G418筛选并扩增培养后,总共获得1070个克隆.通过分析标记基因DsRed和GFP在这些克隆中的表达情况:Cre介导的删除效率为91.1%,定点置换效率为29.3%.最后对部分克隆进行了PCR和DNA印迹鉴定,分子鉴定结果与发光的表型状况一致.这一方法为Cre/lox系统在转基因家畜生产中的进一步应用提供了实验依据. 展开更多
关键词 lox2272 LOXP CRE 标记基因删除 靶基因置换
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