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林氏扇头蜱脂质运载蛋白RL22表达量分析及重组蛋白抗蜱效果
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作者 陈杰 谢子芳 +5 位作者 彭维祺 朱勇川 黎明成 赵建国 王金花 管庆丰 《中国热带医学》 北大核心 2025年第6期735-741,共7页
目的探究林氏扇头蜱RL22蛋白的基本理化性质,对RL22在蜱不同发育时期和不同组织中的相对表达量进行分析,并通过动物试验评估RL22作为抗蜱候选抗原的潜力。方法通过收集各时期的蜱、组织样本,提取RNA反转录成cDNA进行qPCR和数据分析;合成... 目的探究林氏扇头蜱RL22蛋白的基本理化性质,对RL22在蜱不同发育时期和不同组织中的相对表达量进行分析,并通过动物试验评估RL22作为抗蜱候选抗原的潜力。方法通过收集各时期的蜱、组织样本,提取RNA反转录成cDNA进行qPCR和数据分析;合成PET28a-RL22表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行原核表达、纯化。将纯化后的蛋白用于对新西兰兔的免疫接种试验,通过ELISA、蛋白免疫印迹法(Western blot)测定rRL22的免疫原性及其免疫反应性,通过对攻毒后蜱的饱血体质量、产卵重量、吸血时长、孵化率的测定,评估RL22作为抗蜱候选疫苗的潜力。结果RL22氨基酸长度为177 aa,具备长度18 aa的信号肽,是亲水稳定酸性的分泌蛋白。RL22在19-36 aa、48-53 aa、61-67 aa、76-86 aa、94-109 aa、112-122 aa、147-148 aa、150-158 aa、170-173 aa处存在B细胞线性表位,同源建模显示其N端、C端具备α螺旋结构,且具有典型的β-桶状保守空间结构。RL22在不同时期的蜱中都有一定表达,在饱血蜱中肠中表达最高;通过免疫接种后,rRL22使得宿主新西兰兔产生了特异性抗体,35 d时抗体的滴度达1∶256000;免疫攻毒试验结果表明rRL22提供了一定的保护效果,在饱血体质量、产卵量、孵化率方面分别比PBS对照组下降7.2%、9.4%、6.4%,但是差异无统计学意义,同时发现rRL22显著延长了蜱吸血的时间。结论RL22为亲水酸性分泌蛋白,存在多个B细胞表位,推测其为脂质运载蛋白家族成员。RL22在试验测定的蜱各个发育时期均有表达,尤其在饱血若蜱中表达量最高。重组表达的rRL22蛋白对免疫的新西兰兔有一定的抗蜱保护效果。本研究对抗蜱候选疫苗的开发具有重要参考价值。 展开更多
关键词 林氏扇头蜱 RL22蛋白 免疫原性 抗蜱疫苗 生物信息学
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林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like基因原核表达及抗菌功能 被引量:1
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作者 彭维祺 谢子芳 +4 位作者 李晴 黎明成 陈杰 朱勇川 赵建国 《中国热带医学》 北大核心 2025年第7期882-889,共8页
目的 探究林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like基因的抗菌功能,为了解林氏扇头蜱先天免疫系统和开发蜱类防控药物、新型抗菌药物替代提供新的参考依据。方法 根据林氏扇头蜱Microplusin-like基因序列设计特异性引物,提取林氏扇头蜱RNA并... 目的 探究林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like基因的抗菌功能,为了解林氏扇头蜱先天免疫系统和开发蜱类防控药物、新型抗菌药物替代提供新的参考依据。方法 根据林氏扇头蜱Microplusin-like基因序列设计特异性引物,提取林氏扇头蜱RNA并反转录为cDNA,通过PCR扩增基因片段,将基因片段连接至pCold-SUMO质粒,构建重组表达载体pCold-SUMO/Microplusin-like后,转入大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经诱导表达、纯化后获得蛋白;通过滤纸片法测定重组蛋白对大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈,通过微量对倍稀释法测定其对大肠埃希菌、沙门菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),并通过测定该蛋白对大肠埃希菌生长曲线、时间-杀菌曲线的影响探究其抑菌效果;通过扫描电镜及透射电镜观察重组蛋白对大肠埃希菌微观形态的影响,并结合分子对接技术探究重组蛋白的抑菌机制。结果 林氏扇头蜱Microplusin-like基因扩增所得片段长度为333 bp,构建了原核表达载体pCold-SUMO/Microplusin-like,经诱导表达、纯化后获得蛋白,大小约为29 kDa。抑菌试验结果表明,重组蛋白对大肠埃希菌(ATCC 25922、1515、987P、K88、K99)及鸡白痢沙门菌CVCC1791的抑菌圈直径分别为15.8、20.58、18.33、15.4、18.24、18.18 mm,表现出中度或高度敏感;MIC(MBC)分别为0.625(5)、0.625(>5)、0.625(5)、1.25(>5)、0.625(>5)、0.625(>5)mg/mL,存在一定差异;对金黄色葡萄球菌无抑制作用;生长曲线及时间-杀菌曲线测定发现,重组蛋白抑菌活性呈浓度依赖性。扫描及透射电镜显示经重组蛋白处理后大肠埃希菌菌体皱缩,边缘模糊,细胞壁及细胞膜出现破损,内容物外泄,细胞内部松散。分子对接显示蛋白通过氢键、盐桥及疏水作用与大肠埃希菌外膜脂多糖转运蛋白结构发生结合。结论 林氏扇头蜱抗菌肽Microplusin-like蛋白具有抗革兰阴性菌活性,初步分析抗菌机制为破坏细胞壁及细胞膜结构,为开发蜱的新防治策略、新型抗生素替代提供了参考依据。 展开更多
关键词 林氏扇头蜱 Microplusin-like基因 抗菌肽 抗菌活性 原核表达
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林氏扇头蜱酰胺酶型分泌蛋白表达及抗菌功能
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作者 谢子芳 彭维祺 +5 位作者 李晴 黎明成 陈杰 朱勇川 赵建国 管庆丰 《中国热带医学》 北大核心 2025年第2期161-165,共5页
目的 探究林氏扇头蜱中的酰胺酶型分泌蛋白(R.ln PGRP-SC1a)的抗菌功能,为蜱虫先天免疫中肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)的功能研究提供参考依据。方法 依据编码区序列设计特异性引物,提取成蜱的RNA并反转录... 目的 探究林氏扇头蜱中的酰胺酶型分泌蛋白(R.ln PGRP-SC1a)的抗菌功能,为蜱虫先天免疫中肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)的功能研究提供参考依据。方法 依据编码区序列设计特异性引物,提取成蜱的RNA并反转录为c DNA,通过PCR扩增R.ln PGRP-SC1a蛋白基因片段,随后将该基因片段连接至质粒p ET32a+,从而构建重组表达载体p ET32a+-R.ln PGRP-SC1a。把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,采用浓度为0.2 mmol/L的IPTG进行低温诱导,促使其在上清中表达,从而获得活性更强的上清蛋白。利用抑菌圈法评估上清蛋白对大肠埃希菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)2种常见致病细菌的抑菌效果。结果 扩增所得的基因片段长度为627 bp,成功构建了原核表达载体p ET32a+-R.ln PGRP-SC1a。经过低温诱导表达,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白,重组蛋白R.ln PGRP-SC1a的大小约为23.63 k D。抗菌结果表明,在同一浓度下,R.ln PGRP-SC1a蛋白对大肠埃希菌无抑制作用,而对金黄色葡萄球菌有抑制作用。R.ln PGRP-SC1a在浓度为5 mg/m L时开始呈现抑菌作用,且随着浓度的升高,抑菌作用增强。与各浓度卡那霉素的抑菌效果相比,其7 mg/m L的抑菌效果相当于1 mg/m L卡那霉素的抑菌效果。同时,R.ln PGRP-SC1a对金黄色葡萄球菌的起效时间为2 h,抑菌作用可持续48 h。结论 本研究成功构建了R.ln PGRP-SC1a重组表达载体,其表达产物具有持久性抗革兰阳性菌的活性,为生物活性抑菌剂的开发提供了可能。 展开更多
关键词 林氏扇头蜱 酰胺酶型R.lnPGRP-SC1a蛋白 蛋白表达 抗菌作用
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林氏扇头蜱Kunitz型蛋白酶抑制剂Boophilin-H2原核表达及抗凝活性
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作者 赵培真 李尧 +6 位作者 余玲玲 谢子芳 陈杰 彭维祺 黎明成 赵建国 管庆丰 《中国热带医学》 CAS 北大核心 2024年第9期1106-1111,共6页
目的克隆林氏扇头蜱Boophilin-H2基因,构建重组表达载体,在大肠埃希菌中表达Boophilin-H2重组蛋白,并检测其抗凝活性。方法通过设计特异性引物,以林氏扇头蜱饱血成蜱RNA反转为cDNA为模板,PCR扩增Bo⁃ophilin-H2基因片段,克隆、连接到质粒... 目的克隆林氏扇头蜱Boophilin-H2基因,构建重组表达载体,在大肠埃希菌中表达Boophilin-H2重组蛋白,并检测其抗凝活性。方法通过设计特异性引物,以林氏扇头蜱饱血成蜱RNA反转为cDNA为模板,PCR扩增Bo⁃ophilin-H2基因片段,克隆、连接到质粒pSmart-I,构建重组表达载体pSmart-I/Boophilin-H2,BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证重组表达载体,将表达载体转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷低温诱导表达,Ni-NTA Resin纯化重组蛋白,12.5%SDS-PAGE检测重组蛋白表达及纯化情况,使用3.8%枸橼酸钠采血管收集新西兰大白兔股静脉血,离心分离吸取上层血浆,利用体外凝血四项检测盘检测重组蛋白抗凝活性。结果扩增并克隆出林氏扇头蜱Boophilin-H2基因片段387 bp,构建出原核表达载体pSmart-I/Boophilin-H2,双酶切验证载体构建成功,转入大肠埃希菌中经0.8 mmol/L IPTG诱导表达16 h,SDS-PAGE检测表明重组蛋白表达在上清液中,主要以可溶形式存在,编码的Boophilin-H2重组蛋白大小在35000左右,纯化Boophilin-H2重组蛋白进行抗凝活性检测表明,重组蛋白能显著延长活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT),并具有浓度依赖性,重组蛋白对凝血酶时间、凝血酶原时间、纤维蛋白原凝血时长的影响差异无统计学意义。结论本研究构建Boophilin-H2表达载体,其表达产物具有很强的APTT抗凝活性,揭示了重组蛋白发挥作用在内源凝血途径,可能作用于内源性凝血因子Ⅷ、Ⅺ、Ⅻ从而阻止血液凝固,为进一步蜱类防控疫苗和抗凝血药物的研发提供了参考依据和理论基础。 展开更多
关键词 林氏扇头蜱 Kunitz型蛋白酶抑制剂 原核表达 抗凝活性
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林氏扇头蜱几丁质酶基因RLCht 1差异表达分析及酶活性检测
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作者 李尧 赵培真 +4 位作者 谢子芳 彭维祺 陈杰 赵建国 管庆丰 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4964-4973,共10页
【目的】蜱的蜕皮发育过程与几丁质合成和水解紧密相关,而几丁质的降解主要是通过几丁质酶来完成。试验旨在分析林氏扇头蜱(Rhipicephalus linnaei)不同时期及各组织中几丁质酶RLCht 1基因序列表达差异、体外异源表达RLCht1蛋白并验证... 【目的】蜱的蜕皮发育过程与几丁质合成和水解紧密相关,而几丁质的降解主要是通过几丁质酶来完成。试验旨在分析林氏扇头蜱(Rhipicephalus linnaei)不同时期及各组织中几丁质酶RLCht 1基因序列表达差异、体外异源表达RLCht1蛋白并验证其几丁质酶活性,为开发安全高效的生物杀蜱剂提供新型靶标思路。【方法】收集不同吸血状态的各时期蜱及雌性饱血成蜱的不同组织样本用于基因差异表达分析,基于血红扇头蜱合神经节转录组中筛选出的推测的几丁质酶(putative chitinase)序列,在林氏扇头蜱中进行扩增并构建重组原核质粒,使用大肠杆菌系统表达林氏扇头蜱几丁质酶蛋白RLCht1,进行包涵体处理后使用镍柱纯化蛋白,预测RLCht1蛋白结构域;通过与3种不同荧光底物发生催化反应,检测纯化的几丁质酶RLCht1的催化活性大小及作用方式。【结果】RLCht 1基因在不同饱血状态下的各个时期及饱血雌成蜱的不同组织中均有表达,饱血若蜱阶段表达量极显著高于卵期(P<0.01),显著高于其他时期(P<0.05),并在饱血雌性成蜱中肠内有较高的表达量;构建了重组质粒RLCht1-pET-28a并成功表达RLCht1蛋白,经包涵体处理后在150 mmol/L咪唑洗脱下得到纯化的RLCht1蛋白,蛋白预测结果显示,RLCht1属于GH18家族几丁质酶;荧光底物酶活性检测表明,RLCht1包涵体溶解液、复性未纯化的原核蛋白、复性纯化浓缩后原核蛋白分别具有0.078与0.350 U/mL的几丁质外切酶活性及0.034 U/mLβ-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性。【结论】RLCht 1基因与若蜱至成蜱阶段的蜕皮活动相关,影响与免疫、消化、体液调节有关的生命活动过程。本研究在林氏扇头蜱中成功表达几丁质酶蛋白,证明了纯化的RLCht1蛋白具有几丁质催化功能,为林氏扇头蜱几丁质酶RLCht1蛋白在今后杀蜱剂开发中的应用提供了理论基础。 展开更多
关键词 林氏扇头蜱 酶活性检测 表达谱 原核表达 包涵体
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Investigation of potentially zoonotic Rickettsia species in dogs and their attached ticks in Malawi through the lens of One Health
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作者 Elisha Chatanga Henson Kainga +10 位作者 John Kothowa Michael Luwe Richard Ssuna Tinotenda Razemba Laston Chimaliro Naoki Hayashi Yuki Ohsugi Yongjin Qiu Kyoko Hayashida Nariaki Nonaka Ryo Nakao 《Science in One Health》 2025年第1期255-262,共8页
Background:The genus Rickettsia in the order Rickettsiales(Alphaproteobacteria)consists of gram-negative obligate intracellular bacteria that infect a wide range of hosts.Epidemiological studies on the occurrence of R... Background:The genus Rickettsia in the order Rickettsiales(Alphaproteobacteria)consists of gram-negative obligate intracellular bacteria that infect a wide range of hosts.Epidemiological studies on the occurrence of Rickettsia spp.and their associated tick vectors are essential to understand their distribution,host range,and transmission mechanisms in nature.This is particularly relevant within the One Health framework,which emphasizes the interconnectedness of animal,human,and environmental health.Methods:To investigate the presence of Rickettsia spp.in dogs and their ticks in Malawi,a molecular survey was conducted.A total of 209 dog blood and 259 tick samples of the species Haemaphysalis elliptica(n=16)and Rhipicephalus linnaei(n=243)were screened using real-time quantitative PCR(qPCR)targeting the citrate synthase(gltA)gene.Positive samples were further characterized via the conventional PCR and Sanger sequencing of gltA and the outer membrane protein A(ompA)genes.Results:Rickettsia DNA was not detected in any dog samples.However,the detection rates in R.linnaei and H.elliptica were 2.5%(n=6)and 6.3%(n=1),respectively.The obtained sequences showed 100% identity with Rickettsia conorii subsp.conorii(n=4),99%-100% with Rickettsia massiliae(n=2),and 100% with Rickettsia rhipicephali(n=1).Phylogenetic analysis clustered these sequences with the corresponding sequences of R.conorii subsp.conorii,R.massiliae,and R.rhipicephali reported from other countries in both gltA and ompA gene-based phylogenetic trees.The detection of R.massiliae and R.rhipicephali in southern Africa suggests expansion of the geographical distribution of these potentially zoonotic Rickettsia species.Conclusion:This is the first report of Rickettsia species detection in ticks collected from dogs in Malawi.The findings highlight the need for further surveillance,including humans and other animals,to better assess the public and veterinary health risks.Public engagement is needed to raise awareness on the role of dogs and their ticks in the transmission of Rickettsia within the One Health approach. 展开更多
关键词 Dog Haemaphysalis elliptica Malawi Rhipicephalus linnaei Rickettsia conorii subsp.conorii Rickettsia massiliae Rickettsia rhipicephali
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