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一种基于截短N蛋白的猪丁型冠状病毒抗体ELISA检测方法的建立 被引量：1
1
作者 王东升 于瑞明 +5 位作者 张莉萍 白英杰 刘霞 王永录 杜晓华 刘新生 《生物工程学报》 北大核心 2025年第7期2760-2773,共14页
为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV... 为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性。同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析。最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测。重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低。以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25μg/mL,37℃包被1 h,BSA封闭液4℃过夜,血清最佳稀释浓度1:50,37℃孵育1 h,酶标二抗最佳稀释比例为1:80000,37℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37℃反应10 min。待检样品的S/P值(样本值–阴性对照值)/(阳性对照值–阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑。检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%。本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 截短N蛋白 IGG抗体 间接ELISA
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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 苏晓月 吕转平 +2 位作者 沈亚安 赵明明 唐思静 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第1期64-69,共6页
为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间... 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 间接ELISA方法 抗体检测 净化
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鸡痘病毒ORF127蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
3
作者 华炯钢 朱寅初 +6 位作者 叶加林 张存 陈柳 倪征 付媛 霍苏馨 云涛 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第10期2057-2065,共9页
为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间... 为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间接ELISA方法,经特异性、敏感性、重复性等试验和临床血清样本检测进行系统验证。结果显示,间接ELISA检测FPV抗体的最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为10μg·mL^(-1),待检血清稀释度为1∶100,酶标二抗稀释度为1∶25000;特异性试验结果显示,除FPV阳性血清呈阳性反应外,与其他6种病毒(新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽腺病毒4型、火鸡疱疹病毒)的阳性血清均无交叉反应;敏感性结果显示,FPV阳性血清稀释800倍后检测结果仍为阳性;批内、批间重复试验结果显示,批内变异系数为1.81%~7.07%,批间变异系数为2.12%~7.16%,均小于10%。临床血清样品检测结果显示,180份血清样本总阳性率为79.4%(143/180)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为免疫鸡群FPV抗体水平监测和FPV流行病学调查提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸡痘病毒 ORF127蛋白 间接ELISA 抗体
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
4
作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA
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鸭短喙矮小综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用
5
作者 朱小丽 王劭 +5 位作者 董慧 程晓霞 江丹丹 肖世峰 陈少莺 陈仕龙 《福建农业学报》 北大核心 2025年第7期649-655,共7页
【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一... 【目的】建立一种快速检测鸭短喙矮小综合征病毒(Short beak and dwarfism syndrome virus,SBDSV)抗体的血清学方法。【方法】以蔗糖密度梯度离心纯化的SBDSV流行株M15,以此灭活全病毒作为固相包被抗原,通过系统性优化反应参数,构建一种高特异性的间接ELISA检测方法,用于鸭短喙矮小综合征病毒(SBDSV)血清抗体的定性分析。【结果】建立的间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:抗原包被浓度0.1 mg·mL^(−1),37℃孵育2 h后再4℃过夜包被;1%BSA 37℃封闭2 h;血清样本1∶200稀释;阴阳性临界值为0.3214。该检测方法特异性好,与其他常见水禽病毒阳性血清均无交叉反应;敏感性高,阳性高免血清(LPAI效价2^(8))1∶204800倍稀释时检测结果仍为阳性;批内、批间重复性好,变异系数均小于6%;利用所建立的ELISA方法对70份SBDSV疑似感染病鸭的血清样品进行检测,检测结果与LPAI检测结果符合率为90%。对福建省648份临床送检1日龄雏鸭血清样品进行检测,抗体阳性率约为48.30%,显示福建省养鸭场存在不同程度的SBDSV感染。【结论】本研究建立的SBDSV血清抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性高,适合大规模血清学检测,可为监测SBDSV在我国的流行情况以及雏鸭母源抗体水平评价提供技术支撑。 展开更多
关键词 鸭短喙矮小综合征 间接ELISA 抗体检测
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葱潜隐病毒吉林分离物的鉴定及ELISA检测方法的建立
6
作者 张春雨 王晨 +3 位作者 刘建青 李小宇 宋景荣 王永志 《植物保护》 北大核心 2025年第6期239-244,共6页
葱潜隐病毒(shallot latent virus,SLV)是影响葱、蒜产量和品质的主要病毒之一,本研究从吉林省珠葱中分离并鉴定了3株SLV,分离物衣壳蛋白(coat protein,CP)的基因序列与已报道的SLV分离物的相似性为78.84%~83.24%;通过原核表达并纯化病... 葱潜隐病毒(shallot latent virus,SLV)是影响葱、蒜产量和品质的主要病毒之一,本研究从吉林省珠葱中分离并鉴定了3株SLV,分离物衣壳蛋白(coat protein,CP)的基因序列与已报道的SLV分离物的相似性为78.84%~83.24%;通过原核表达并纯化病毒CP蛋白,免疫小鼠,制备了多抗血清,效价达256000倍;以纯化的多抗血清为基础建立了SLV的间接ELISA检测方法,优化了反应条件:确定待测样品包被条件为4℃过夜,封闭条件为5%脱脂奶37℃60 min,检测抗体工作浓度125 ng/mL 37℃孵育1 h,酶标抗体工作浓度500 ng/mL 37℃孵育1 h。该方法能够特异性识别感染SLV的珠葱叶片,不识别其他常见珠葱病毒,与RT-PCR方法比较,符合率94%,具有良好的稳定性和准确性。 展开更多
关键词 葱潜隐病毒 珠葱 多克隆抗体 间接ELISA
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新城疫病毒HN蛋白的截短表达及间接ELISA方法建立
7
作者 魏玲 王思怡 +4 位作者 熊荣园 梁洪 王怀禹 李彩虹 杨国淋 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第3期91-95,共5页
为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表... 为了建立一种快速的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)抗体检测方法,试验采用原核表达技术表达HN蛋白,以HN蛋白为检测抗原建立酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,间接ELISA方法检测6种其它鸡病阳性血清均为阴性,其最低抗体检出效价为1∶10240,其与血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition,HI)方法的阳性和阴性符合率分别为98.08%和92.31%,检测临床样品阳性率为91.48%。说明建立的间接ELISA方法可用于NDV免疫抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 新城疫病毒 HN蛋白 截短表达 间接ELISA 抗体检测
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牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用
8
作者 刘兵 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第5期68-75,共8页
为了建立一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体检测方法,本研究对IBRV gD蛋白进行原核表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:gD基因PCR扩增产物约945 bp,构建原核表达载体pET30a-gD,经IPTG诱导表达,Weste... 为了建立一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体检测方法,本研究对IBRV gD蛋白进行原核表达,以表达蛋白为包被抗原建立检测IBRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:gD基因PCR扩增产物约945 bp,构建原核表达载体pET30a-gD,经IPTG诱导表达,Western blot检测显示重组蛋白具有良好的反应活性,以纯化蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)阳性血清均为阴性,检测IBRV阳性血清的最低抗体检出效价为1∶12800,与病毒中和试验方法的符合率为96.15%,批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和8%,检测825份免疫疫苗牛血清样品和514份未免疫疫苗牛血清样品的阳性率分别为90.67%和7.39%。本研究建立的间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、准确性、重复性,为IBRV的临床诊断、流行病学调查、免疫抗体监测、疫苗免疫效果评价等提供了一种简单快速的血清学检测方法。 展开更多
关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白 原核表达 间接ELISA
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施马伦贝格病毒N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
9
作者 李阳 孙睿雪 +3 位作者 陈天杰 刘思彤 曹家慧 赵建军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3877-3887,共11页
[目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌... [目的]建立一种具有良好特异性和敏感性的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)抗体间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)检测方法。[方法]将SBV N蛋白编码基因全长序列克隆至pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET-28a-SBV,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的SBV N蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种iELISA方法,并对其包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育时间等反应条件进行优化,检测其阴阳性临界值、特异性、灵敏性和重复性。[结果]SDS-PAGE结果显示,SBV N蛋白分子质量为30 ku;Western blotting结果显示,纯化后SBV N蛋白与SBV阳性血清能产生特异性反应。本研究建立的SBV iELISA检测方法最佳条件为:SBV N抗原包被浓度4μg/mL、4℃包被12 h、1%明胶37℃封闭1 h、血清稀释度为1:200、37℃孵育1 h、1:6 000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h,其阴阳性临界值为0.371。该iELISA检测方法仅与SBV阳性血清产生特异性反应,与牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和阿卡斑病毒(AKAV)阳性血清均无明显交叉反应,灵敏性较高,SBV阳性血清稀释度为1:1280时仍有明显反应。批间重复试验和批内重复试验变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其总符合率为94.57%。[结论]本研究建立了一种以SBV N蛋白为检测抗原的SBV iELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于SBV血清学检测,试验结果为SBV的快速诊断提供更多选择。 展开更多
关键词 施马伦贝格病毒(SBV) N蛋白 间接ELISA(iELISA) 原核表达
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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：4
10
作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) VP6蛋白 截短表达 间接ELISA
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
11
作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪肺炎支原体重组蛋白p46真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
12
作者 许世萱 孙亚宁 +5 位作者 邢云瑞 杨苏珍 郭军庆 乔松林 陈鑫鑫 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期77-83,共7页
为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被... 为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被抗原,优化反应条件,确定阴性、阳性临界值,建立猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,并对方法的敏感性、稳定性、特异性进行评价。结果显示,p46重组蛋白分子质量大小为48.0 ku,纯度在90%以上,特异性和反应性良好。建立的间接ELISA检测方法最优检测条件为:抗原包被浓度为5μg/mL,采用本实验室封闭液37℃封闭120 min,待检血清1∶50稀释,37℃孵育30 min,二抗稀释度为1∶10000,37℃孵育30 min,TMB室温显色20 min。结果判定标准为:OD 450>0.2887为阳性,OD 450<0.2487为阴性,0.2487≤OD 450≤0.2887为可疑。建立的基于猪肺炎支原体p46蛋白的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,与IDEXX的间接ELISA检测试剂盒检测的阴性、阳性血清符合率分别为100%、93.3%,研究结果为猪肺炎支原体抗体检测和免疫评价提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 p46蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断方法的建立 被引量：1
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作者 庄勇 向蒙 +6 位作者 冯桂丹 杨显超 夏炉明 肖文轩 张蒙 王建 张鹭 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期125-133,共9页
本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动... 本研究通过前期已构建好一些优势抗原的表达载体库,以生物信息学工具分析候选抗原的理化性质、二级结构、B细胞抗原表位,选择优势抗原,以纯化后的融合抗原ECX作为包被抗原,将HRP标记的Protein G作为酶标的二抗,成功建立了一种用于多动物结核分枝杆菌复合群间接ELISA诊断的方法。该方法适用于实验室样品批量检测,其敏感性为0.912,特异性为0.949。应用本研究建立的动物结核分枝杆菌间接ELISA法和商品化动物结核分枝杆菌夹心ELISA抗体检测试剂盒共检测犬、猫、野生动物、SPF实验动物血清共552份。其中间接ELISA方法共检出6份血清抗体阳性,阳性检出率为1.09%(6/552);商品化夹心法试剂盒共检出8份血清抗体阳性,阳性检出率为1.45%(8/552);两者之间阳性重合数为6份,阳性重合率为85.72%(6/7);阴性重合数为544份,阴性重合率为99.82%(544/545)。结果表明,两种诊断方法的检测结果具有较高的一致性。本方法的建立,与国外商品化试剂盒比较,不但有望实现这类检测产品的国产替代,同时实现了一种方法对不同物种来源血清的快速检测。 展开更多
关键词 抗原 结核分枝杆菌复合群 ECX 间接ELISA
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A型塞内卡病毒3AB蛋白原核表达及间接ELISA方法的初步建立 被引量：1
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作者 郑君佐 张中旺 +6 位作者 马中元 梁志博 白英杰 赵永聪 潘丽 包世俊 吕建亮 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第3期338-345,共8页
为建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)非结构蛋白(NSP)3AB抗体的间接ELISA方法,本研究利用原核表达系统成功表达了重组SVA3AB蛋白,使用重组SVA3AB蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法。结果显示,重组SVA 3AB蛋白以可溶性形式表达,大小为1... 为建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)非结构蛋白(NSP)3AB抗体的间接ELISA方法,本研究利用原核表达系统成功表达了重组SVA3AB蛋白,使用重组SVA3AB蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法。结果显示,重组SVA 3AB蛋白以可溶性形式表达,大小为18 k Da,能够与SVA抗体发生特异性反应。建立的间接ELISA方法:抗原最适包被质量浓度为1μg/m L;最佳封闭液为3%脱脂奶粉溶液;待检血清最佳稀释度为1∶640;酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000;避光显色时间为10 min。该ELISA方法与猪口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清、猪伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清以及猪圆环病毒(PCV)阳性血清均不发生交叉反应;敏感性达到1∶6 400;批内变异系数小于8%,批间变异系数小于10%。研究结果表明,该间接ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性好,可用于临床上猪血清样品的检测,为SVA的鉴别诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪A型塞内卡病毒 非结构蛋白3AB 原核表达 间接ELISA
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基于HN蛋白的牛副流感病毒3型间接ELISA检测方法的建立及初步应用 被引量：2
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作者 李红 安瑞 +5 位作者 李驰欢 朱思萍 董玉来 吴同垒 史秋梅 张志强 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第3期397-403,共7页
为建立牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)血清学检测方法,本试验对BPIV3的HN、NP、F、P蛋白进行原核表达、纯化,筛选最适蛋白包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,成功表达了BPIV3的4种重组蛋白rHN、rNP... 为建立牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)血清学检测方法,本试验对BPIV3的HN、NP、F、P蛋白进行原核表达、纯化,筛选最适蛋白包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,成功表达了BPIV3的4种重组蛋白rHN、rNP、rF和rP;棋盘滴定结果显示,rHN蛋白作为包被蛋白具有最高的P/N值,因此用于后续方法建立。摸索间接ELISA的最适反应条件:抗原包被质量浓度为0.5 mg/L,37℃1.5 h;5%脱脂牛奶,4℃过夜封闭;血清1∶50稀释,37℃孵育1 h;二抗稀释度为1∶10000,37℃孵育0.5 h;底物反应条件为37℃12 min。特异性试验结果显示,所建立的方法能够特异性识别BPIV3抗体阳性血清,且灵敏度达到1∶800,批内与批间重复性的检测中变异系数均小于10%,与SVANOVIR试剂盒检测同一批样品的总符合率为92.22%。应用该方法对河北地区192份血清样品进行检测,血清中BPIV3抗体阳性率为66.15%。结果表明,本试验构建的BPIV3抗体间接ELISA检测方法适用于临床大规模血清学调查。 展开更多
关键词 牛副流感病毒3型(BPIV3) HN蛋白 间接ELISA 原核表达
原文传递
口蹄疫病毒通用型结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
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作者 张慧艳 李坤 +6 位作者 孙梦阳 邢向川 付元芳 李平花 李冬 卢曾军 曹轶梅 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第8期1011-1017,共7页
为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法,本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原,经过条件优化,建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法,并分析了该方法的... 为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法,本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原,经过条件优化,建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法,并分析了该方法的敏感性、特异性、重复性以及与液相阻断ELISA(LPB-ELISA)的符合性。结果显示,该短肽最佳包被浓度为2μg/m L,最适封闭液为1%BSA+5%蔗糖,血清最佳稀释度为1∶4,酶标二抗稀释比例为1∶5000。以约登指数最大作为临界值,测定其敏感性为87.5%,特异性为93%,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清均未出现交叉反应,且批间与批内变异系数均≤10%。与LPB-ELISA的符合率为92.59%。该方法耗时短、操作简捷,可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体,为FMDV感染的诊断和群体免疫状况的评估提供了一种通用方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 结构蛋白VP2 通用型 间接ELISA
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鸭疫里默氏杆菌血清2型ELISA抗体检测方法的建立和应用 被引量：1
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作者 陈美潼 郭容 +1 位作者 高崧 于圣青 《微生物学通报》 北大核心 2025年第10期4813-4823,共11页
【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染对家禽养殖业造成了巨大的经济损失。RA血清型众多且相互之间没有交叉保护,因此,建立一种快速检测方法鉴定流行菌株的血清型,并制备血清型特异性的疫苗进行免疫对于防治该病具... 【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染对家禽养殖业造成了巨大的经济损失。RA血清型众多且相互之间没有交叉保护,因此,建立一种快速检测方法鉴定流行菌株的血清型,并制备血清型特异性的疫苗进行免疫对于防治该病具有重要的意义。【目的】建立一种血清2型特异性的鸭疫里默氏杆菌ELISA抗体检测方法,能够有效地检测2型RA感染和免疫鸭血清中的特异性抗体。【方法】通过热酚水法(hot phenol-water method)提取鸭疫里默氏杆菌血清2型菌株脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),包被ELISA板。通过优化抗原包被条件、待检血清/兔抗鸭酶标抗体的稀释倍数和孵育条件,以及底物的显色时间等反应条件,建立一种检测血清2型RA抗体的间接ELISA方法。【结果】优化反应条件后确定的最佳方案为:以5μg/mL LPS作为包被抗原、100μL/孔PBS作为包被液加入酶标板,4℃包被12 h;以5%脱脂奶粉作为封闭液、200μL/孔,37℃封闭2 h;待测血清稀释度为1:400、孵育时间为1 h;兔抗鸭酶标二抗稀释度为1:10000,孵育时间为1 h;显色时间为5 min。该反应条件下的P/N平均值最大。通过检测80份健康非免疫鸭血清,按平均值+3个标准差(standard deviation,SD)确立阳性判断标准为OD_(450)≥0.151。特异性试验结果表明:该方法检测RA血清2型阳性血清为阳性结果;检测RA血清1型、6型、7型和10型鸭阳性血清、禽致病性大肠杆菌阳性鸭血清、禽巴氏杆菌阳性鸭血清、禽沙门菌阳性鸭血清、呼肠孤病毒阳性鸭血清和雏鸭肝炎阳性鸭血清均呈阴性结果。敏感性试验结果表明:对阳性鸭血清的检测限度为>50000倍稀释。重复性试验结果表明:该检测方法的批间和批内变异率均小于10%。该检测方法对血清2型RA感染7 d后鸭血清中的抗体检测结果为100%阳性;对血清2型RA灭活疫苗免疫后的抗体检测结果表明,免疫后14 d的血清抗体阳性率为80%、免疫后28 d的血清抗体阳性率为100%。【结论】该方法的建立填补了鸭疫里默氏杆菌血清2型特异性抗体检测方法的空白,为RA的流行病学调查和疫苗研发提供了有效的数据支持与科学依据,具有重要的理论和应用价值。 展开更多
关键词 鸭疫里默氏杆菌 脂多糖 间接ELISA 抗体检测方法
原文传递
基于Stefin抗原兔豆状囊尾蚴病间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
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作者 王由森 石正发 +6 位作者 车亮 张月玥 羊倩倩 李甲 肖琴 孙晓林 王泽祥 《甘肃农业大学学报》 北大核心 2025年第1期1-9,共9页
【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包... 【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包被条件、封闭条件、血清稀释度、酶标二抗稀释度、反应时间、温度等条件,以阳性血清与阴性血清的D_(450 nm)比值(P/N)作为判断标准优化反应条件,并对ELISA方法的敏感性、特异性、重复性进行检测。【结果】测定了重组蛋白浓度。间接ELISA检测方法临界值为0.352。阳性血清稀释倍数至1∶12800时,D_(450 nm)的值仍大于临界值。兔球虫、兔弓形虫等阳性血清检测显示D_(450 nm)均小于0.352。【结论】Stefin蛋白可以大批量获得,以stefin作为抗原建立的间接ELISA检测方法可以应用于豆状囊尾蚴病的诊断和流行病学调查研究,对豆状囊尾蚴病的有效防控具有重要的意义。 展开更多
关键词 豆状囊尾蚴 BRADFORD 间接ELISA Stefin
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基于副结核分枝杆菌重组MAP0827c蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用 被引量：1
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作者 俞杰 许淑芸 +3 位作者 魏京京 魏增科 赵昌乐 周霞 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第3期271-277,共7页
为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c... 为建立快速准确检测副结核分枝杆菌(MAP)抗体的间接ELISA方法,本研究通过SignalP-5.0等相关网站分析MAP0827c蛋白的生物信息学特点,设计扩增MAP MAP0827c基因的引物,将扩增的MAP0827c基因克隆于pET-32a(+)中构建重组质粒pET32a-MAP0827c,并经酶切和测序鉴定正确后利用原核表达系统表达重组MAP0827c蛋白,以该蛋白作为包被抗原,采用棋盘滴定法筛选间接ELISA反应条件,确定临界值,以异源阳性血清验证该方法的特异性;通过稀释阳性血清评估所建方法的灵敏性;以5份牛MAP阳性血清进行该方法的批内和批间试验评估该方法的重复性。结果显示,MAP0827c蛋白由374个氨基酸构成,含15个抗原决定簇,不存在跨膜区和信号肽,二级结构以α螺旋为主。经原核系统表达了分子量为42 ku的目的蛋白。建立的ELISA方法蛋白最佳包被量为0.05μg/mL,一抗血清最佳稀释倍数为1:100,二抗兔抗牛IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:5000,封闭液选择1%明胶封闭1 h,一抗血清作用时为1 h,酶标二抗孵育时间为1 h,显色时间为25 min;特异性试验结果显示,建立的间接ELISA方法仅对MAP阳性血清检测为阳性,而不与布鲁氏菌、结核分枝杆菌及金黄色葡萄球菌的牛阳性血清发生反应,特异性强;敏感性试验结果显示,可检测的阳性血清最大稀释度为1:800,敏感性高;批内和批间重复试验结果显示,变异系数均小于10%,重复性较好。采用建立的ELISA方法和商品化ELISA试剂盒对70份临床牛血清样品进行检测,结果显示,二者的阳性检出率分别为30%(21/70)和34.29%(24/70),二者的总符合率为95.71%。本研究首次建立了基于MAP0827c蛋白的检测MAP抗体的间接ELISA方法,为MAP流行病学调查和检测提供了可行技术手段。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 MAP0827c蛋白 原核表达 抗体 间接ELISA
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牛冠状病毒单克隆抗体制备及亚型鉴定
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作者 范昊宇 蒋蔚 +13 位作者 汪萍 宫震 韩翔舒 白航飞 刘姝悦 李月 张立雪 付修龙 杜玮 阿依江·木合塔尔 平继辉 朱启运 蒋松 夏俊 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第12期116-123,共8页
旨在制备牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)单克隆抗体(MAb),为BCoV疫苗制备和建立免疫胶体金等特异性检测方法奠定基础。使用原核表达系统制备重组BCoV N蛋白,BCoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠;以N蛋白和全病毒为抗原,通过间接ELISA... 旨在制备牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)单克隆抗体(MAb),为BCoV疫苗制备和建立免疫胶体金等特异性检测方法奠定基础。使用原核表达系统制备重组BCoV N蛋白,BCoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠;以N蛋白和全病毒为抗原,通过间接ELISA法检测抗体效价。经细胞融合与5轮亚克隆,筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株。采用腹水法制备单克隆抗体并纯化,通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot验证抗体反应性与特异性。结果:筛选出3株针对BCoV N蛋白的杂交瘤细胞株(2D12C、3D6E、4D1F),分泌的单克隆抗体轻链均为Kappa链,2D12C与4D1F重链为IgG2a亚型,3D6E重链为IgG1亚型;IFA试验表明3株单克隆抗体均能与BCoV发生特异性结合;Western blot证明3株单克隆抗体与BCoV和重组表达BCoV N蛋白均反应良好,且3株单克隆抗体与感染牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒及牛副流感病毒3型的细胞均不发生特异性反应。综上,制备了3株特异性较高、生物学活性良好的BCoV单克隆抗体,为后续疫苗制备及检测方法研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体 间接ELSIA
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