Introduction:The establishment of a highthroughput quantification approach for waterborne pathogenic protozoa and helminths is crucial for rapid screening and health risk assessment.Methods:We developed a high-through...Introduction:The establishment of a highthroughput quantification approach for waterborne pathogenic protozoa and helminths is crucial for rapid screening and health risk assessment.Methods:We developed a high-throughput quantitative polymerase chain reaction(HT-qPCR)assay targeting 19 waterborne protozoa and 3 waterborne helminths and validated its sensitivity,specificity,and repeatability.The assay was then applied to test various environmental media samples.Results:The HT-qPCR assay's limit of detection(LOD)was 5×10^(2) copies/μL DNA,and its specificity was confirmed using Giardia and Cryptosporidium standards.Repeatability,assessed through intra-and inter-group experiments,yielded a coefficient of variation(CV)of 1.0%–4.6%and 1.2%–6.4%at concentrations of 1×10^(5) and 1×10^(4) copies/μL,respectively.The R^(2) values of the 22 standard curves ranged from 0.983 to 0.998,with amplification efficiencies between 80%and 107%.In drinking water sources,sludge from municipal wastewater treatment plants(MWTPs),and livestock manure samples,17 of 22 targets were detected,with Acanthamoeba genus(50.0%),Acanthamoeba castellanii(11.8%),and Enterocytozoon bieneusi(11.8%)showing high prevalence.Cryptosporidium spp.,Enterocytozoon bieneusi,and Cyclospora cayetanensis were simultaneously found in all three sample types.Discussion:This study presents a useful tool for the rapid detection of waterborne protozoa and helminths in complex environmental microbiomes,providing scientific data for monitoring cross-media transmission and controlling microbial risk from a One Health perspective.展开更多
为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特...为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。展开更多
依托前期55℃高温胁迫下耐干苔藓齿肋赤藓的转录组数据,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quanti⁃tative Real time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)技术,探究9个高温差异表达基因(ScLEA14、ScGSTF11、ScHSP70-17、ScHsfB4b、ScMYB11...依托前期55℃高温胁迫下耐干苔藓齿肋赤藓的转录组数据,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quanti⁃tative Real time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)技术,探究9个高温差异表达基因(ScLEA14、ScGSTF11、ScHSP70-17、ScHsfB4b、ScMYB117、ScGLK1、ScERF039、ScERF016、ScbHLH104)在高温、干旱-复水及NaCl胁迫下的表达特征,以此验证转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)数据的可靠性,为后续齿肋赤藓抗逆基因功能验证提供理论支撑。结果显示:(1)9个基因在高温胁迫下的表达趋势与RNA-Seq数据基本一致。(2)在极端高温和干旱-复水胁迫时,9个基因均被不同程度诱导,其中3个基因在干旱24 h时诱导至表达峰值,8个基因在复水阶段诱导效果更为突出。(3)在NaCl盐胁迫下,9个耐热相关基因均受盐诱导而上调表达,其中6个基因表现尤为显著。由此得出:ScLEA14、ScMYB117、ScERF016这3个基因在极端高温、干旱-复水和NaCl高盐胁迫下均显著诱导表达,可作为后续抗逆研究的候选基因。展开更多
随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法...随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。展开更多
基金Supported by the National Key Research and Development Program of China(2022YFC3204703)the China Postdoctoral Innovation Talents Support Program(BX20230400).
文摘Introduction:The establishment of a highthroughput quantification approach for waterborne pathogenic protozoa and helminths is crucial for rapid screening and health risk assessment.Methods:We developed a high-throughput quantitative polymerase chain reaction(HT-qPCR)assay targeting 19 waterborne protozoa and 3 waterborne helminths and validated its sensitivity,specificity,and repeatability.The assay was then applied to test various environmental media samples.Results:The HT-qPCR assay's limit of detection(LOD)was 5×10^(2) copies/μL DNA,and its specificity was confirmed using Giardia and Cryptosporidium standards.Repeatability,assessed through intra-and inter-group experiments,yielded a coefficient of variation(CV)of 1.0%–4.6%and 1.2%–6.4%at concentrations of 1×10^(5) and 1×10^(4) copies/μL,respectively.The R^(2) values of the 22 standard curves ranged from 0.983 to 0.998,with amplification efficiencies between 80%and 107%.In drinking water sources,sludge from municipal wastewater treatment plants(MWTPs),and livestock manure samples,17 of 22 targets were detected,with Acanthamoeba genus(50.0%),Acanthamoeba castellanii(11.8%),and Enterocytozoon bieneusi(11.8%)showing high prevalence.Cryptosporidium spp.,Enterocytozoon bieneusi,and Cyclospora cayetanensis were simultaneously found in all three sample types.Discussion:This study presents a useful tool for the rapid detection of waterborne protozoa and helminths in complex environmental microbiomes,providing scientific data for monitoring cross-media transmission and controlling microbial risk from a One Health perspective.
文摘为建立一种能同时检测牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)这4种病原的方法,本研究分别以BPIV3和BRSV的P基因、IBRV的gI基因和BVDV的5'UTR基因为靶基因设计特异性引物和探针,构建质粒标准品pUC57-BPIV3-P、pUC57-BRSV-P、pUC57-IBRV-gI和PVC57-BVDV-5'UTR,并经PCR和测序鉴定正确后等体积比混合作为模板,采用方阵法对引物、探针和各反应条件等的优化,初步建立引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)4种病毒性病原的多重TaqMan qPCR检测方法。结果显示,建立的多重qPCR仅能特异性检测BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV,与引起BRDC其他病原的牛冠状病毒(BCoV)、牛支原体(M-bov)、牛多杀性巴氏杆菌(Pm)、牛溶血性曼氏杆菌(Mh)均无交叉反应;对1:1:1:1混合的4种质粒标准品的检测限均为10拷贝/μL;组内和组间重复性试验的变异系数均小于1%;以本研究方法和国家标准检测法对149份临床样品平行检测BVDV,结果显示两种方法的总符合率分别为80.85%,以本研究方法和已有专利中的多重qPCR方法对149份临床样品平行检测BPIV3、BRSV、IBRV,结果显示两种方法的总符合率分别为75.07%、100%和92.83%,临床样品中存在4种病原8种混合感染情况。结果表明,本研究建立的致BRDC的4种病毒多重Taq Man qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于BPIV3、BRSV、IBRV和BVDV这4种常见牛病毒的鉴别检测和流行病学调查,为养殖场BRDC的防控奠定基础。
文摘依托前期55℃高温胁迫下耐干苔藓齿肋赤藓的转录组数据,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quanti⁃tative Real time Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)技术,探究9个高温差异表达基因(ScLEA14、ScGSTF11、ScHSP70-17、ScHsfB4b、ScMYB117、ScGLK1、ScERF039、ScERF016、ScbHLH104)在高温、干旱-复水及NaCl胁迫下的表达特征,以此验证转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)数据的可靠性,为后续齿肋赤藓抗逆基因功能验证提供理论支撑。结果显示:(1)9个基因在高温胁迫下的表达趋势与RNA-Seq数据基本一致。(2)在极端高温和干旱-复水胁迫时,9个基因均被不同程度诱导,其中3个基因在干旱24 h时诱导至表达峰值,8个基因在复水阶段诱导效果更为突出。(3)在NaCl盐胁迫下,9个耐热相关基因均受盐诱导而上调表达,其中6个基因表现尤为显著。由此得出:ScLEA14、ScMYB117、ScERF016这3个基因在极端高温、干旱-复水和NaCl高盐胁迫下均显著诱导表达,可作为后续抗逆研究的候选基因。
文摘目的 基于ICH Q2(R2)和Q14,建立冻干甲型肝炎减毒活疫苗(简称冻甲疫苗)感染性滴度细胞培养-RT-qPCR快速检测方法,并对方法进行优化及验证。方法 采用分析质量源于设计(Analytical Quality by Design,AQbD)理念,通过分析目标概况(Acceptance Test Procedure,ATP)设定、风险识别与实验设计(Design of Experiment,DoE),建立细胞培养-RT-qPCR联合检测平台。以病毒核酸扩增循环阈值(cycle threshold,Ct)为响应指标,优化细胞密度、病毒培养温度和时间等关键参数。验证方法的专属性、线性、中间精密度,确定定量范围,Bland-Altman分析与传统滴度检测方法的一致性。结果 共识别13个主要风险因素,确定方法的最适反应条件为:细胞密度(1~2)×10^(5)个/mL;病毒稀释梯度间距4倍;96孔细胞培养板有边缘效应;病毒吸附温度和时间为37℃吸附60 min,病毒培养温度和时间为35℃培养72 h;PCR无位置效应;变性温度和时间为90℃变性63 s;逆转录温度和时间为60℃逆转录15 min;计算模型为双对数线性模型。该方法具有良好的专属性(灭活病毒对照Ct值> 28)、线性(R2=0.966)及中间精密度[几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)≤9.28%],定量范围覆盖5.0~8.0 lgCCID50/mL。该方法与传统方法检测结果差值的95%一致性界限(95%limits of agree-ment,95%LoA)为-0.06~0.41 lgCCID50/mL。结论 建立的细胞培养-RT-qPCR检测方法将检测周期由传统方法的21~28 d缩短至3 d,且具有定量准确、通量高等优势,为冻甲疫苗工艺过程中及成品甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)滴度检测和批签发效率提升提供了关键技术支持。
文摘随着水环境中新污染物抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的污染愈加严重,受到越来越多的关注,基于定量聚合酶链反应的检测方法的统一化显得尤为重要。本研究选用污水、湖水等不同水样,在直接过膜法和低温冷冻高速离心法这2种不同预处理方法下,使用2种广泛采用的DNA提取方法(FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒、天根Magnetic Soil and Stool DNA Kit磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒),对水样中的DNA进行提取,然后建立qPCR方法进一步对12种抗生素抗性基因和1类整合子进行定量检测。本研究拟从菌体富集效率、DNA提取效果和定量质控等方面优化预处理、DNA提取和qPCR定量检测等步骤。结果发现,直接过膜的前处理方法使得DNA提取浓度和菌体富集效率更高。FastDNA^(TM)SPIN Kit for Soil试剂盒提取的DNA浓度更高。同时,建议在定量过程中添加以超纯水为基质的空白对照来避免引物二聚体的干扰。为了减少qPCR测量的变异性并提高精密度,每次qPCR运行包括一式三份的标准曲线的样品,并添加阳性对照。使用认证的标准品验证qPCR所得结果的正确度,以提高准确性并支持实验室间的均一性。本研究旨在提供一种可靠高效的抗生素ARGs的qPCR检测技术,为构建水环境中抗生素ARGs检测的质量控制体系提供了参考。
