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鸽腺病毒Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 宋育聪 杨奕曼 +2 位作者 舒建洪 冯华朋 何玉龙 《生命的化学》 2026年第3期533-541,共9页
为建立一种基于鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)Hexon蛋白的抗原或抗体检测方法,通过NCBI数据库检索获取鸽腺病毒Ⅱ型(pigeon adenovirus typeⅡ,PIAdV-Ⅱ)Hexon基因的氨基酸序列。BLAST序列比对筛选同源性高的氨基酸序列,经密码子... 为建立一种基于鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)Hexon蛋白的抗原或抗体检测方法,通过NCBI数据库检索获取鸽腺病毒Ⅱ型(pigeon adenovirus typeⅡ,PIAdV-Ⅱ)Hexon基因的氨基酸序列。BLAST序列比对筛选同源性高的氨基酸序列,经密码子优化后合成Hexon蛋白的编码基因。通过限制性内切酶酶切后,将目的基因克隆至pET-32a载体,借助热激法将构建好的重组质粒pET-32a-Hexon转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达并利用Ni-NTA纯化获得重组Hexon蛋白。经SDS-PAGE与Western blot鉴定正确的重组Hexon蛋白免疫新西兰大白兔以制备抗Hexon蛋白的多克隆抗体。结果证实,在37°C条件下,使用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h后,重组Hexon蛋白主要以包涵体形式表达。经Western blot验证,复性后重组Hexon蛋白展现出良好的免疫原性;以此重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经间接ELISA测定其效价达1∶1280000,Western blot证实其能与重组Hexon蛋白特异性结合。总之,本研究通过原核大肠杆菌表达系统制备了重组PiAdV Hexon蛋白,并以其为抗原制备出效价高、特异性强的多克隆抗体,为后续建立基于Hexon蛋白的PiAdV ELISA检测方法提供了材料支撑。 展开更多
关键词 鸽腺病毒 hexon 原核表达 多克隆抗体
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血清4型禽腺病毒Hexon-Penton串联蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量:4
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作者 庞洪泽 吴同垒 +2 位作者 李蕴玉 李佩国 闫艳娟 《中国家禽》 北大核心 2019年第7期20-24,共5页
为了获得血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon)和五邻体蛋白(Penton)的串联蛋白及其多克隆抗体血清,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出Hexon基因和Penton基因,使用重叠PCR将Hexon基因和Penton基因串联,得到Hexon-Penton(... 为了获得血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体蛋白(Hexon)和五邻体蛋白(Penton)的串联蛋白及其多克隆抗体血清,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出Hexon基因和Penton基因,使用重叠PCR将Hexon基因和Penton基因串联,得到Hexon-Penton(HP)串联基因,将HP基因导入表达载体pET32a(+),获得重组质粒pET32a-HP,将其转化表达菌株BL21经IPTG诱导表达,得到HP原核蛋白,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,HP原核蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体血清。SDS-PAGE分析显示,HP原核蛋白分子质量约为108 ku,Western Blot结果显示,HP原核蛋白可与His标签抗体和多克隆抗体血清特异性识别,说明HP原核蛋白具有良好的免疫原性,为进一步建立FAdV-4的血清学检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 血清4型禽腺病毒 六邻体蛋白 五邻体蛋白 多克隆抗体血清
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血清4型禽腺病毒hexon-penton串联蛋白在293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 庞洪泽 吴同垒 +2 位作者 李蕴玉 李佩国 闫艳娟 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1109-1113,共5页
为了获得293T细胞表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体(hexon)和五邻体(penton)的串联蛋白,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出hexon基因和penton基因,其大小分别为1014,900 bp。使用重叠PCR将hexon基因和penton基因串联,得到h... 为了获得293T细胞表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)六邻体(hexon)和五邻体(penton)的串联蛋白,采用PCR方法从因FAdV-4致死的鸡肝脏中扩增出hexon基因和penton基因,其大小分别为1014,900 bp。使用重叠PCR将hexon基因和penton基因串联,得到hexon-penton(HP)串联基因。将HP基因导入表达质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-HP,转染293T细胞,获得HP真核蛋白。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定结果表明,HP真核蛋白可与多抗血清发生特异性反应,蛋白质相对分子质量约为90000,HP串联蛋白在293T细胞中获得了良好表达。研究结果表明成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HP,并在真核细胞中获得表达,为进一步研制FAdV-4核酸疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 血清4型禽腺病毒 六邻体蛋白 五邻体蛋白 真核蛋白
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禽腺病毒4型Penton蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 岳筠 王涵钰 +4 位作者 毛以智 李乔斌 赵超 冯孝傲 程振涛 《贵州畜牧兽医》 2025年第4期29-31,共3页
为了对禽腺病毒4型(FAdV-4)的早期快速诊断与有效防控奠定基础,采用BL21(DE3)细胞表达FAdV-4 Penton蛋白,免疫BALB/c小鼠,用PEG将脾细胞与SP2/0细胞融合,并用HAT培养基与间接ELISA方法培养和筛选阳性杂交瘤细胞,应用间接ELISA方法和West... 为了对禽腺病毒4型(FAdV-4)的早期快速诊断与有效防控奠定基础,采用BL21(DE3)细胞表达FAdV-4 Penton蛋白,免疫BALB/c小鼠,用PEG将脾细胞与SP2/0细胞融合,并用HAT培养基与间接ELISA方法培养和筛选阳性杂交瘤细胞,应用间接ELISA方法和Western blotting测定单克隆抗体的效价和反应原性,制备小鼠腹水单克隆抗体。结果:通过脾细胞制备、细胞融合、杂交瘤细胞筛选获得1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为F12)。其培养物上清与重组蛋白Penton呈现特异性反应,证明杂交瘤细胞F12能够稳定分泌特异性抗体。制备的小鼠腹水单克隆抗体效价为1∶200,Western blotting结果显示腹水抗体与目的蛋白呈现特异性条带。结论:试验成功获得1株分泌特异性抗体的FAdV-4 Penton蛋白杂交瘤细胞株(F12),制备的腹水单克隆抗体可用于FAdV-4检测。 展开更多
关键词 禽腺病毒4型 penton蛋白 单克隆抗体
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融合禽腺病毒4型和8a型Hexon蛋白亚单位疫苗免疫效果的评价
5
作者 胡茜 赵超 +5 位作者 岳筠 韩帅博 李应分 张青艳 吴筑君 程振涛 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第10期1341-1349,共9页
为制备能够同时防控禽腺病毒4型(FAdV-4)和8a型(FAdV-8a)的亚单位多价疫苗,表达FAdV-4与FAdV-8a Hexon蛋白片段及其二价融合蛋白制备疫苗,并评价免疫效果。分别利用SDS-PAGE以及Westernblot鉴定重组蛋白的表达与免疫原性;用重组蛋白制... 为制备能够同时防控禽腺病毒4型(FAdV-4)和8a型(FAdV-8a)的亚单位多价疫苗,表达FAdV-4与FAdV-8a Hexon蛋白片段及其二价融合蛋白制备疫苗,并评价免疫效果。分别利用SDS-PAGE以及Westernblot鉴定重组蛋白的表达与免疫原性;用重组蛋白制备疫苗进行动物免疫并分别用FAdV-4与FAdV-8a进行攻毒;应用ELISA检测血清特异性抗体分泌水平及IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6表达水平,并对实验动物进行剖检病变观察和组织病理学观察。结果可见:重组蛋白以包涵体形式进行表达并可与禽腺病毒阳性血清发生特异性反应;各组亚单位疫苗诱导产生的特异性抗体均极显著高于对照组(P<0.01),各组亚单位疫苗诱导产生的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6水平也均极显著高于对照组(P<0.01);攻毒组剖检后可见部分心包积液以及鸡的肝组织存在不同程度的出血点和黄染,而各免疫组鸡肝与对照组相比无明显变化;组织病理学观察可见攻毒组肝细胞中嗜碱性包涵体以及细胞间存在炎性细胞浸润等现象,而各免疫组未观察到明显病变。本研究表明构建的禽腺病毒4型和8a型Hexon二价融合蛋白疫苗能诱导高水平的免疫应答以提升对雏鸡的保护率并改善病毒感染所致的鸡肝组织损伤,为针对禽腺病毒的防控研究提供了依据。 展开更多
关键词 禽腺病毒4型 禽腺病毒8a型 hexon 亚单位疫苗 免疫效果
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周口地区D群禽腺病毒ZK01株Hexon和Fiber基因的克隆及遗传进化分析
6
作者 尹坤 卢渊录 +2 位作者 梁路 田开月 黄玉波 《现代畜牧兽医》 2025年第11期1-6,共6页
研究旨在明确周口地区某肉鸡养殖场D群禽腺病毒(FAdV)Hexon和Fiber基因遗传变异情况,对疑似阳性的鸡肝脏样品进行PCR扩增、测序及序列分析。结果显示,克隆的ZK01株Hexon和Fiber基因与D群FAdV FJSW2021毒株亲缘关系较近,编码序列(CDS)大... 研究旨在明确周口地区某肉鸡养殖场D群禽腺病毒(FAdV)Hexon和Fiber基因遗传变异情况,对疑似阳性的鸡肝脏样品进行PCR扩增、测序及序列分析。结果显示,克隆的ZK01株Hexon和Fiber基因与D群FAdV FJSW2021毒株亲缘关系较近,编码序列(CDS)大小分别为2853 bp和1719 bp。ZK01株与FJSW2021毒株核苷酸同源性最高,分别为100.0%和99.9%;但与血清11型参考毒株380株差异性较大,同源性分别仅为97.9%和95.8%,且Hexon基因存在多处无义突变。研究表明,周口地区鸡群中存在D群FAdV流行株,这为该地区FAdV的分子流行病学监测及防控提供了一定参考。 展开更多
关键词 禽腺病毒 血清11型 hexon基因 Fiber基因 遗传进化分析
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禽腺病毒8a型贵州株的Penton基因遗传进化分析及其编码蛋白结构预测
7
作者 洪清峰 韩帅博 +6 位作者 朱二鹏 赵超 龙秀文 张妹妹 余琴 欧萍 程振涛 《贵州畜牧兽医》 2025年第2期20-23,共4页
为了解禽腺病毒8a型(FAdV-8a)贵州株GZ-8a的遗传进化情况及其Penton基因编码蛋白的结构,对pMD19-T-FAdV-8a-Penton阳性克隆质粒进行测序,利用DNAStar的MEGA软件构建遗传进化树并进行同源性分析;分别通过在线软件ProtParam分析理化性质,P... 为了解禽腺病毒8a型(FAdV-8a)贵州株GZ-8a的遗传进化情况及其Penton基因编码蛋白的结构,对pMD19-T-FAdV-8a-Penton阳性克隆质粒进行测序,利用DNAStar的MEGA软件构建遗传进化树并进行同源性分析;分别通过在线软件ProtParam分析理化性质,Protscale分析亲疏水性,SignalP-6.0预测蛋白质信号肽,TMHMM 2.0分析跨膜域,SOPMA预测二级结构,SWISS-MODEL预测三级结构,通过GMQE和QMEANDisCo Global的数值评估模型质量,并将预测的三级结构与模型6qi5.1.T比较覆盖率与相似度。结果:贵州株GZ-8a与河南株HLJ1968的同源性最高,亲缘关系最近;不同地区FAdV-E的Penton基因同源性为99.5%~100%,变异程度低。GZ-8a Penton基因序列共编码553个氨基酸,GZ-8a Penton蛋白分子质量为59 868.46 Da,属于亲水性酸性蛋白,不存在信号肽且无跨膜结构;Penton蛋白分子的二、三级结构α螺旋占21.70%,无规卷曲占55.52%,扩展链占22.78%,以无规卷曲为主要结构;蛋白GMQE值为0.69,QMEANDisCo Global值为0.66±0.05;与模型6qi5.1.T相比,覆盖率为81%,相似度为45%,匹配度较高。 展开更多
关键词 禽腺病毒8a 贵州株GZ-8a penton基因 遗传进化 蛋白质结构
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Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株Hexon蛋白全基因序列测定和酶切位点分析 被引量:20
8
作者 李海英 尹燕博 +3 位作者 徐守振 王建琳 王晓红 王守春 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期33-37,43,共6页
利用3对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增,并进行序列测定和PCR-RFLP分析,通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。结果显示,Hexon基因全长为2 800左右个核苷酸,编码约... 利用3对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增,并进行序列测定和PCR-RFLP分析,通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。结果显示,Hexon基因全长为2 800左右个核苷酸,编码约940个氨基酸,不同血清型之间的同源性为75.2%~99.5%,变异范围是0.0%~24.3%。推导的氨基酸同源性为20.7%~98.8%,差异性为0.0%~24.2%。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价Ⅰ群禽腺病毒家族的种系发育关系,构建的进化树显示出5个主要的分支。选用限制性内切酶HaeⅡ,利用存在差异的Hexon序列片段D特异性可以有效区分大部分血清型。结果表明,获得了Ⅰ群禽腺病毒12个血清型不同毒株的Hexon全基因序列并进行了分子进化分析,同时结合12个血清型PCR-RFLP分析,为进一步分析鉴别Ⅰ群禽腺病毒不同血清型提供依据。 展开更多
关键词 Ⅰ群禽腺病毒 hexon全基因 序列分析 PCR-RFLP
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鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析 被引量:11
9
作者 陈亮 黄路生 +3 位作者 刘晓文 刘玲 陈芳艳 王林川 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1538-1542,共5页
为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。... 为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。结果表明:接种病毒后第36~72小时,鸭胚集中出现死亡,胚体全身弥漫性出血,ELD_(50)为1×10^(6.31)/m L;分离的病毒不凝集鸡、鸭红细胞,在鸭胚成纤维细胞上可致细胞变圆、折光性增强等病变。将0.1 m L病毒液经肌肉接种1日龄泥鸭,主要引起雏鸭肝、脾出血和肿大。分离株hexon基因与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株(登录号:KR135164.1)和GR株(登录号:NC_024486.1)的核苷酸同源性分别为100%和76.6%。本试验为深入研究鸭2型腺病毒的致病机制及综合防控提供了重要的基础数据。 展开更多
关键词 鸭2型腺病毒 分离鉴定 hexon基因
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禽腺病毒Hexon蛋白多克隆抗体制备及特异性鉴定 被引量:7
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作者 牛玉娟 孙芹芹 +6 位作者 赵君 孙伟 张会霞 张桂华 肖一红 商营利 刘思当 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2018年第6期928-932,共5页
本研究旨在制备禽腺病毒(FAd V)Hexon蛋白多克隆抗体并对其特异性进行分析鉴定。通过构建重组的原核表达载体p ET-28a-Hexon,转入表达菌E. coli BL21 (DE3),IPTG诱导,并运用SDS-PAGE进行重组蛋白的鉴定,最后纯化蛋白。利用纯化的融合蛋... 本研究旨在制备禽腺病毒(FAd V)Hexon蛋白多克隆抗体并对其特异性进行分析鉴定。通过构建重组的原核表达载体p ET-28a-Hexon,转入表达菌E. coli BL21 (DE3),IPTG诱导,并运用SDS-PAGE进行重组蛋白的鉴定,最后纯化蛋白。利用纯化的融合蛋白进行常规新西兰大白兔免疫,以制备Hexon蛋白的多克隆抗体。采用间接免疫荧光、免疫组织化学和Western blot的方法鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明,Hexon蛋白的原核表达量较高,并且是以包涵体的形式存在,分子质量大小约为43 k Da;免疫兔后获得能与FAd V发生特异性反应且高效价的多克隆抗体。因此,本试验制备的FAd V Hexon蛋白的多克隆抗体证明特异性良好,为后期禽腺病毒病的诊断、致病机制研究及亚单位疫苗的研制提供了良好的物质基础。 展开更多
关键词 禽腺病毒 hexon基因 多克隆抗体 特异性
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Ⅰ群禽腺病毒penton蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 被引量:5
11
作者 侯力丹 陈晓春 +5 位作者 薛麒 邓永 孔冬妮 杨承槐 刘丹 李俊平 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期41-46,共6页
在同源性分析基础上,确定了12个血清型penton蛋白同源性最高的2段基因并通过linker进行连接,以该串联基因原核表达蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备并筛选到2株可分泌FAdV-Ⅰpenton蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(Mab-penton-6#和M... 在同源性分析基础上,确定了12个血清型penton蛋白同源性最高的2段基因并通过linker进行连接,以该串联基因原核表达蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备并筛选到2株可分泌FAdV-Ⅰpenton蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系(Mab-penton-6#和Mab-penton-9#)。2株单克隆抗体小鼠腹水经间接免疫荧光等鉴定,可识别FAdV-Ⅰ的所有血清型代表毒株,与鸡减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽呼肠孤病毒等均不发生反应,特异性良好,效价分别为1∶8000和1∶4000,最终选取Mab-penton-6#大量制备单克隆抗体。本试验成功研制出FAdV-I的penton蛋白单克隆抗体,为FAdV-Ⅰ检测方法的建立奠定了良好基础。 展开更多
关键词 禽腺病毒I群 单克隆抗体 penton蛋白
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犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建 被引量:5
12
作者 陶玉成 马素贞 +3 位作者 陈胜男 刘腾飞 申卫红 简子健 《新疆农业大学学报》 CAS 北大核心 2010年第3期214-218,共5页
通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已... 通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。 展开更多
关键词 犬传染性肝炎 hexon基因 克隆 原核表达质粒
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鸭腺病毒A型Hexon基因克隆与序列分析 被引量:5
13
作者 万春和 刘荣昌 +6 位作者 陈翠腾 程龙飞 傅光华 傅秋玲 施少华 陈红梅 黄瑜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第10期3042-3048,共7页
为明确鸭腺病毒A型Hexon基因特征及其在腺病毒科病毒分类中的作用,本研究从前期分离鉴定的一株番鸭源鸭腺病毒A型分离株(JX2016株)中分段扩增获得其Hexon基因编码区。结果发现,鸭腺病毒A型JX2016株Hexon基因编码区为2 733 bp,编码910个... 为明确鸭腺病毒A型Hexon基因特征及其在腺病毒科病毒分类中的作用,本研究从前期分离鉴定的一株番鸭源鸭腺病毒A型分离株(JX2016株)中分段扩增获得其Hexon基因编码区。结果发现,鸭腺病毒A型JX2016株Hexon基因编码区为2 733 bp,编码910个氨基酸,与鸭腺病毒A型(FJ12025株)核苷酸同源性最高,达99.8%;与其他分离株Hexon基因核苷酸同源性均在99.4%以上;与鸭腺病毒2型(GR株,未明确分类地位)同源性仅为54.5%;与禽腺病毒A型Phelps株(鸡源)及P29株(鹅源)的核苷酸同源性分别为53.6%和55.2%。遗传进化树分析发现,所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支,且与绵羊腺病毒D型(OAV287株)均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型(GR株)与禽腺病毒A型Phelps株(鸡源)、P29株(鹅源)却处于同一遗传进化分支,均属于禽腺病毒属遗传进化分支。基于Hexon蛋白的遗传进化分析,建议将鸭腺病毒A型重新命名为鸭源富AT腺病毒A型,将鸭腺病毒2型重新命名为鸭源禽腺病毒。 展开更多
关键词 鸭腺病毒A型 hexon基因 序列分析 遗传进化 分类
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禽腺病毒4型河南株Hexon全基因的克隆及遗传进化分析 被引量:12
14
作者 张宇 乔涵 +3 位作者 徐朋丽 杨兴武 韩昊莹 陈红英 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2017年第6期30-36,共7页
【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品... 【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品进行了Hexon全基因的扩增、克隆、测序和遗传进化分析。【结果】通过扩增Hexon基因421bp的片段,成功建立了禽腺病毒4型的PCR检测方法;40份家禽肝脏样品中,PCR检测显示35份为FAV-4阳性,阳性率为87.5%;成功扩增了包含Hexon基因全序列的片段,长度为2 889bp;7株FAV-4河南株的Hexon基因与GenBank中的12株FAV-4参考毒株Hexon基因序列之间核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,与参考株相比存在碱基的插入、突变现象;FAV-4河南株Hexon全基因推导的氨基酸序列与参考株之间的同源性为98.2%~99.8%,且发生变化的位置集中在前段和中段。【结论】FAV-4河南株与印度分离株亲缘关系较近,但与韩国分离株亲缘关系相对较远。 展开更多
关键词 禽心包积水-包涵体肝炎综合征 禽腺病毒4型 hexon全基因
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鸭腺病毒3型Hexon基因的克隆及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立 被引量:4
15
作者 陈翠腾 万春和 +6 位作者 程龙飞 傅光华 施少华 刘荣昌 陈珍 朱春华 黄瑜 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1104-1112,共9页
鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3... 鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,克隆的W1FJ株Hexon基因全长为2 814 bp,编码937个氨基酸,和DAdV-3(CH-GD-12-2014株)核苷酸同源性为100%,但和鸭源禽腺病毒B型(也称鸭腺病毒2型,DAdV-2,GR株)核苷酸同源性仅为76.6%。Hexon蛋白遗传进化分析表明,W1FJ株和CH-GD-12-2014株在遗传进化上形成一个独立的分支,与鸭源禽腺病毒B型和鹅源禽腺病毒A型(goose aviadenovirus A)在遗传进化上明显不同,建议将其命名为鸭源禽腺病毒C型(duck aviadenovirus C)。建立的检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为61拷贝/μL;特异性强,和鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性单峰,Tm值为(81.48±0.25)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.49%~1.64%和0.67%~2.40%。本试验为DAdV-3的科学分类和后续开展DAdV-3感染的流行病学调查及致病机理研究奠定基础。 展开更多
关键词 鸭腺病毒3型 hexon基因 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法
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Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量:6
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作者 张曼 韩飞 +1 位作者 高睿 何亚鹏 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期634-640,共7页
旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法。将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并... 旨在原核表达Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的Hexon蛋白,并以Hexon蛋白为包被抗原建立血清的间接ELISA检测方法。将FAVⅠ群Hexon基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组Hexon蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Westernblot鉴定;纯化后的Hexon蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清的间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果表明,原核表达获得大小约为37.4ku的重组Hexon蛋白;Westernblot结果表明重组蛋白有良好的特异性和抗原反应性。FAVⅠ间接ELISA法优化反应条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0mg/L,封闭条件为37℃作用1h,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.322为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明,对鸡新城疫、禽流感、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对阳性血清的敏感性可达1∶1 200,70份阳性血清的阳性率为97.1%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别为1.2%~3.5%和5.1%~8.3%;用此方法对临床279份鸡血清样品检测的阳性率为51.3%。表明建立的ELISA检测方法可用于FAVⅠ抗体水平的检测。 展开更多
关键词 Ⅰ群禽腺病毒 hexon蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪腺病毒3型免疫过氧化物酶单层细胞染色检测方法的建立及初步应用
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作者 唐艺彤 刘婷 +8 位作者 于向前 李雨昕 曾沛暄 朱丹 崔雅湘 吴慧蓉 曾婉佳 唐青海 危艳武 《畜牧与兽医》 北大核心 2026年第3期66-74,共9页
旨在建立一种猪腺病毒3型(PADV-3)抗体检测方法并开展临床血清抗体的调查与分析。利用PCR扩增PADV-3的Hexon和Protease基因,构建重组真核表达载体pEGFP-PADV-3-Hexon和pEGFP-PADV-3-Protease,采用双酶切及测序鉴定;将真核表达载体pEGFP-... 旨在建立一种猪腺病毒3型(PADV-3)抗体检测方法并开展临床血清抗体的调查与分析。利用PCR扩增PADV-3的Hexon和Protease基因,构建重组真核表达载体pEGFP-PADV-3-Hexon和pEGFP-PADV-3-Protease,采用双酶切及测序鉴定;将真核表达载体pEGFP-PADV-3-Hexon和pEGFP-PADV-3-Protease分别转染HEK293细胞,激光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位,通过G418筛选,建立稳定表达Hexon或Protease重组蛋白的2种细胞系,以其作为包被抗原,建立免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)对采自山东、山西、四川、黑龙江等地猪场的血清样品进行PADV-3 Hexon和Protease特异性抗体检测。结果:PADV-3 Hexon基因和PADV-3 Protease基因的读码框(ORF)分别为2 775 bp和615 bp,重组蛋白Hexon定位在细胞质中,Protease在胞质和胞核中均匀分布,G418筛选得到了稳定表达Hexon或Protease重组蛋白的2个细胞系。IPMA检测显示,来自12个猪场的446份血清样品中,Hexon抗体阳性率为39.69%,Protease抗体阳性率为34.75%;Hexon和Protease双抗体阳性率为32.29%;PADV-3抗体阳性样品合计188份,总阳性率为42.15%;哺乳仔猪、保育猪、育成猪、母猪和种公猪抗体阳性率依次为50.00%、36.64%、86.84%、47.37%和87.50%。综上,本研究成功建立了PADV-3抗体的IPMA检测方法,并证实PADV-3感染较为普遍,为进一步开展该病毒感染的防治提供了流行病学基础数据。 展开更多
关键词 猪腺病毒3型 Protease基因 hexon基因 血清抗体 免疫过氧化物酶单层细胞染色法
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基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:2
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作者 李鹏 雷梦瑶 +9 位作者 冯丽丽 王振伟 管春晓 郑洪双 王俊茹 王利平 李炎锦 吴欣媛 刘兴友 金前跃 《河南农业科学》 北大核心 2024年第7期133-141,共9页
Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,... Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。 展开更多
关键词 禽腺病毒血清4型 penton蛋白 间接ELISA 抗体检测
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Ⅰ群禽腺病毒hexon基因分型与序列分析 被引量:6
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作者 朱小甫 吴旭锦 《动物医学进展》 北大核心 2018年第10期46-49,共4页
对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV h... 对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV hexon基因片段。结果表明,构建系统进化树发现,其中HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP共7株属于FAdV-4型,而GS株属于FAdV-1型。7株FAdV-4型毒株核苷酸同源性在99.9%~100%之间,推导的氨基酸序列同源性均为100%,提示这7株FAdV-4型流行毒株高度同源。FAdV-1型的GS与CELO株核苷酸、推导的氨基酸序列同源性均为99.2%,提示GS与CELO株亲缘关系较近。在鸡群中发现存在FAdV-1型和FAdV-4型Ⅰ群禽腺病毒,各血清型毒株之间高度同源,毒株遗传稳定性高。 展开更多
关键词 I群禽腺病毒 hexon基因 序列分析 基因分型
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猪腺病毒3型Hexon蛋白多克隆抗体制备与免疫活性鉴定 被引量:14
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作者 汪镇南 唐青海 +1 位作者 颜爱 刘云福 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第1期1-8,共8页
本研究旨在制备猪腺病毒3型(PADV-3)Hexon蛋白多克隆抗体。试验构建重组原核表达载体pET28a-Hexon,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行Western blotting鉴定,目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫家兔制备Hexon蛋白多克隆抗体。采用免疫... 本研究旨在制备猪腺病毒3型(PADV-3)Hexon蛋白多克隆抗体。试验构建重组原核表达载体pET28a-Hexon,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行Western blotting鉴定,目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫家兔制备Hexon蛋白多克隆抗体。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度。结果显示,Hexon蛋白原核表达以包涵体形式存在,分子质量约为105ku;真核细胞表达的Hexon蛋白均定位于HEK293细胞质内,细胞核内无分布;IPMA测定所制备的多克隆抗体滴度为1∶1 600,该抗体与体外培养的PADV-3及稳定表达Hexon蛋白的细胞均呈特异性反应。结果表明本试验制备的PADV-3型Hexon蛋白多克隆抗体免疫活性和特异性良好。 展开更多
关键词 猪腺病毒3型 hexon基因 多克隆抗体
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