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结核杆菌含信号肽的Mtb8·4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及鉴定
1
作者 李晖 李榕 +1 位作者 钟森 任红 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2006年第4期482-485,共4页
目的:克隆含信号肽的Mtb8·4(MS)/hIL12嵌合基因,构建其真核表达质粒,并进行鉴定。方法:以pcDNA3·1(+)-含信号肽的Mtb8·4(pMS)质粒为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-n... 目的:克隆含信号肽的Mtb8·4(MS)/hIL12嵌合基因,构建其真核表达质粒,并进行鉴定。方法:以pcDNA3·1(+)-含信号肽的Mtb8·4(pMS)质粒为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker(pMSL)重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL12基因,将hIL12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等方法进行鉴定。结果:MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功。结论:MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 结核病 含信号肽的Mtb8.4(MS) hil12 嵌合基因
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Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性 被引量：2
2
作者 李晖 李榕 +3 位作者 钟森 罗月贝 任红 邓存良 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期597-600,共4页
目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列... 目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。 展开更多
关键词 结核病 MTB8.4 hIL.12 嵌合基因 免疫原性
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人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达 被引量：2
3
作者 王伟 高江平 +5 位作者 阎瑾琦 肖毅 任杰 王宇 江乐 于继云 《军医进修学院学报》 CAS 2010年第6期600-603,共4页
目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检... 目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。 展开更多
关键词 白细胞介素12 基因融合 真核细胞 IRES
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马铃薯块茎特异性启动子克隆及其驱动的hIL12表达载体构建 被引量：7
4
作者 杨加伟 李伟 葛正龙 《合肥医学院学报》 2014年第4期387-392,共6页
目的克隆马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的人白细胞介素-12(hIL12)植物表达载体。方法提取马铃薯基因组DNA作为模板,根据Genebank数据库信息设计Ppatatin序列特异性引物,通过PCR扩增获得Ppatatin片段,并进行测序鉴定... 目的克隆马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的人白细胞介素-12(hIL12)植物表达载体。方法提取马铃薯基因组DNA作为模板,根据Genebank数据库信息设计Ppatatin序列特异性引物,通过PCR扩增获得Ppatatin片段,并进行测序鉴定;利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析;通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Ppatatin驱动的hIL12表达载体。结果成功从马铃薯基因组中扩增得到了1019 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Ppatatin驱动的hIL12植物表达载体。结论获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础。 展开更多
关键词 Ppatatin启动子 人白细胞介素-12 表达载体 植物生物反应器
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马铃薯叶片特异性启动子克隆分析及其驱动的人白细胞介素-12表达载体构建 被引量：8
5
作者 杨加伟 程小玲 葛正龙 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期875-881,共7页
利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究热点。本研究利用PCR技术从马铃薯基因组中克隆其叶片组织特异性启动子Prbcs后,利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析,接着通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体... 利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究热点。本研究利用PCR技术从马铃薯基因组中克隆其叶片组织特异性启动子Prbcs后,利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析,接着通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Prbcs驱动的药用蛋白人白细胞介素12(hIL12)表达载体。结果显示,本研究成功从马铃薯基因组中扩增得到了623 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Prbcs驱动的hIL12植物表达载体。本研究获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础。 展开更多
关键词 Prbcs启动子 人白细胞介素-12 表达载体 植物生物反应器
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马铃薯叶特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化 被引量：3
6
作者 杨加伟 龙朝康 葛正龙 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1625-1630,共6页
利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究的热点之一。本研究利用前期构建的Prbcs驱动的h IL12植物表达载体,导入根瘤农杆菌后侵染马铃薯,通过筛选、分化等过程,获得转基因马铃薯植株。结果显示,获得13个独... 利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究的热点之一。本研究利用前期构建的Prbcs驱动的h IL12植物表达载体,导入根瘤农杆菌后侵染马铃薯,通过筛选、分化等过程,获得转基因马铃薯植株。结果显示,获得13个独立的转h IL12基因阳性马铃薯株系,GUS染色分析表明外源基因成功获得表达,且具有良好的遗传稳定性。本研究获得的Prbcs驱动的h IL12转基因马铃薯植株,为下一步利用马铃薯高效表达生产h IL-12蛋白打下了基础。 展开更多
关键词 马铃薯 Prbcs启动子 人白细胞介素-12 植物生物反应器
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