Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫原性 被引量：2

1

作者 李晖 李榕 +3 位作者 钟森 罗月贝 任红 邓存良 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期597-600,共4页

目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列... 目的:构建克隆结核分枝杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗,并在COS7细胞中表达,研究该疫苗的免疫原性。方法:克隆Mtb8.4/hIL12嵌合基因,并导入真核表达载体pCIneo中,构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组真核质粒。用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等鉴定后,转染COS7细胞,用RTPCR和Westernblot鉴定Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平的表达。用Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗免疫C57BL/6N小鼠,收集脾细胞培养上清检测细胞因子的水平,并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤作用。结果:pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒构建成功。以其转染COS7细胞后,Mtb8.4/hIL12嵌合基因在转录水平获得表达。Mtb8.4/hIL12嵌合基因疫苗能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,IFNγ和IL2的分泌增加,IL4的分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强。结论:成功地构建pCIneoMtb8.4/hIL12重组质粒,并在COS7细胞中表达。构建的Mtb8.4/hIL12基因疫苗具有较强的免疫原性,可明显诱导CTL的杀伤活性。 展开更多

关键词 结核病 MTB8.4 hil.12 嵌合基因 免疫原性

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结核病Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗免疫保护效果研究 被引量：6

2

作者 李晖 李榕 +5 位作者 钟森 李强 任红 黄永茂 陈宣世 龙汉安 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期139-143,共5页

目的研究Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将雌性C57BL/6N小鼠40只,随机分为5组,即Mtb8.4/hIL-12嵌合基因、Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、空载体组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清液检测细胞因... 目的研究Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将雌性C57BL/6N小鼠40只,随机分为5组,即Mtb8.4/hIL-12嵌合基因、Mtb8.4基因疫苗组、BCG组、空载体组和PBS组。小鼠脾细胞培养上清液检测细胞因子水平;并按效靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行细胞毒性T细胞(CTL)杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果Mtb8.4/hIL-12嵌合基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻,其效果优于卡介苗(BCG)组和Mtb8.4基因疫苗组。结论hIL-12与Mtb8.4构建成嵌合基因疫苗后,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。 展开更多

关键词 结核病 Mtb8.4/hil-12 嵌合基因 基因疫苗 免疫保护

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表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用 被引量：4

3

作者 赵善民 张彩勤 +5 位作者 赵勇 毛峰峰 白冰 张海 师长宏 徐志凯 《科学技术与工程》 北大核心 2012年第2期415-417,共3页

评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分... 评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。 展开更多

关键词 重组耻垢分枝杆菌 结核分枝杆菌 HBHA hil-12

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hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定 被引量：2

4

作者 张艳丽 张文卿 +3 位作者 王秋波 丁守怡 吕锐 董海 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期987-991,共5页

目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之... 目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。 展开更多

关键词 hil-12 HER2/NEU ECD pIMP1 生孢梭菌

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人白细胞介素-12(hIL-12)基因在杆状病毒表达载体系统中的表达 被引量：2

5

作者 杨林 张晓馨 +3 位作者 陈新华 龙綮新 王珣章 李迎秋 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期35-42,共8页

人白细胞介素 1 2 (hIL 1 2 )是细胞介导免疫发生的关键调节因子 ,也是目前发现的唯一的异源二聚体细胞因子 ,由P35和P40两个亚基经二硫键连接而成。利用DNA重组技术 ,分别构建了含hIL 1 2 p35基因和 p40基因的重组转移载体质粒pAcAB3 ... 人白细胞介素 1 2 (hIL 1 2 )是细胞介导免疫发生的关键调节因子 ,也是目前发现的唯一的异源二聚体细胞因子 ,由P35和P40两个亚基经二硫键连接而成。利用DNA重组技术 ,分别构建了含hIL 1 2 p35基因和 p40基因的重组转移载体质粒pAcAB3 p35和pAcAB3 p40。将两个重组转移载体分别与致死缺陷型线性化苜蓿丫纹液蛾核型多角体病毒 (AcNPVBaculoGoldLinearizedBaculovirus)基因DNA共转染昆虫细胞 ,构建出遗传稳定的重组病毒AcNPV OCC hIL 1 2 (p35)与AcNPV OCC- hIL 1 2 (p40 )。将两种病毒分别感染Sf9细胞 ,取细胞培养物上清和细胞裂解物上清进行SDS PAGE和Westernblot检测 ,结果显示hIL 1 2p35和 p40两基因均在昆虫细胞中获得表达 ,且能分泌至胞外。表达产物具有免疫原性。 展开更多

关键词 人白细胞介素 杆状病毒表达系统 表达

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结核杆菌Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建与表达

6

作者 李晖 李榕 +1 位作者 钟森 任红 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第3期213-217,共5页

目的　克隆结核分枝杆菌Mtb8.4 /hIL12嵌合基因 ,导入真核表达载体pCI neo ,并在真核细胞中进行表达。方法　采用基因工程技术 ,首先以 pcDNA3.1(+) -Mtb8.4为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出Mtb8.4 linker基因 ,与 pCI neo载体进行... 目的　克隆结核分枝杆菌Mtb8.4 /hIL12嵌合基因 ,导入真核表达载体pCI neo ,并在真核细胞中进行表达。方法　采用基因工程技术 ,首先以 pcDNA3.1(+) -Mtb8.4为模板 ,经聚合酶链反应 (PCR)扩增出Mtb8.4 linker基因 ,与 pCI neo载体进行连接重组 ,构建成pCI neo Mtb8.4 linker(pML)重组质粒 ,然后以 pORF hIL12质粒为模板 ,经PCR扩增出hIL 12基因 ,将hIL 12基因与 pML质粒进行连接重组 ,构建成Mtb8.4 /hIL12嵌合基因真核表达质粒 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定 ;重组嵌合质粒转染COS - 7细胞后 ,用RT PCR方法鉴定Mtb8.4 /hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。结果　Mtb8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功 ;转染COS - 7细胞后 ,Mtb8.4 /hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。结论　Mtb8.4 /hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS- 7细胞中的成功表达 ,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病Mtb8.4 展开更多

关键词 结核病 MTB8.4 hil-12 嵌合基因

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HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

7

作者 杜晓媛 杜珍武 +3 位作者 张桂珍 杨绍娟 卜莉莎 高申 《中国实验诊断学》 北大核心 2010年第6期821-823,共3页

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制... 目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。 展开更多

关键词 基因治疗 HSV-TK hil-12

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阳离子脂质体介导的hIL-12基因在COS-7细胞中的表达

8

作者 周鹤峰 邵敏 葛正龙 《齐齐哈尔医学院学报》 2005年第7期750-751,共2页

目的观察hIL-12基因在COS-7细胞中的表达。方法阳离子脂质体LipofectamineTM2000将质粒pCA13-hIL-12转入COS-7细胞,PCR法检测基因转染,ELISA法检测hIL-12的表达。结果hIL-12基因成功导入COS-7细胞,并且在COS-7细胞中获得表达。结论hIL-1... 目的观察hIL-12基因在COS-7细胞中的表达。方法阳离子脂质体LipofectamineTM2000将质粒pCA13-hIL-12转入COS-7细胞,PCR法检测基因转染,ELISA法检测hIL-12的表达。结果hIL-12基因成功导入COS-7细胞,并且在COS-7细胞中获得表达。结论hIL-12可以在COS-7细胞中获得表达。 展开更多

关键词 阳离子脂质体 hil-12基因 COS-7细胞 表达 转染细胞 基因转染

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共表达siRNA和hIL-12的新型乙肝多表位DNA疫苗的研究 被引量：2

9

作者 黄镜贤 曹以诚 +2 位作者 杜正平 陶嫦立 杨化强 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期36-42,共7页

目的:构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法:设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白(EGFP... 目的:构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因的表达。方法:设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspHI位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的MluI位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hIL12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。结果:经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;转染后48hhIL-12的检出量为1289pg/ml细胞上清,72h检出量为1712pg/ml细胞上清;转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。结论:成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果,为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。 展开更多

关键词 乙型肝炎 DNA疫苗 多表位抗原 hil-12 SIRNA

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经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体的构建及体外实验研究

10

作者 赵静 李星 +3 位作者 王顺娟 王菲 王东阳 夏海滨 《现代肿瘤医学》 CAS 2013年第7期1480-1485,共6页

目的:构建经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a的新型腺病毒载体并进行体外实验研究。方法:采用常规基因克隆和同源重组技术,构建在E3区携带hIL-12B(p40)和在纤维蛋白及E4区之间携带hIFN-α2a及eGFP表达框的经嵌合纤维蛋... 目的:构建经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a的新型腺病毒载体并进行体外实验研究。方法:采用常规基因克隆和同源重组技术,构建在E3区携带hIL-12B(p40)和在纤维蛋白及E4区之间携带hIFN-α2a及eGFP表达框的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的嵌合型腺病毒骨架质粒载体pAd5/35-Backbone.E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP。此外,采用分子克隆手段构建携带hIL-12A(p35)的腺病毒E1穿梭载体pAd5-E1-CMV-hIL-12A(p35)。PCR法鉴定腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒。将上述所获得的两种质粒载体经过PacI线性化后共转染HEK293细胞包装新型病毒载体。将纯化的腺病毒感染人恶性胶质瘤细胞U87MG,48小时后,荧光显微镜下观察报告基因eGFP的表达,RT-PCR检测hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达。结果:PCR法检测到所构建的腺病毒骨架载体及穿梭载体质粒成功携带所需的目的基因。成功包装并纯化获得新型腺病毒载体pAd5/35.E1-CMV-hIL-12A(p35)/E3-CMV-hIL-12B(p40)/E4-hIFN-α2a-eGFP。体外感染U87MG细胞,48h后荧光显微镜下可以观察到报告基因eGFP的表达,RT-PCR可以检测到hIL-12及hIFN-α2a目的基因的表达。结论:体外实验结果表明,成功制备的经嵌合纤维蛋白Ad5/35修饰的双表达hIL-12和hIFN-α2a新型腺病毒载体,为进一步探讨其在恶性脑胶质瘤动物模型中的体内治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 人白介素12 人干扰素α2a 腺病毒载体 嵌合纤维蛋白 构建

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应用重组PCR技术构建人单链白细胞介素12融合基因 被引量：11

11

作者 张梅 司履生 王一理 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期22-26,共5页

目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (G... 目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3碱基序列进行前后拼接 (IL- 12 p40 -多肽接头 - p35 ) ,构建 hsc IL- 12融合基因 ,并进行核苷酸序列测定 ,进一步将 hsc IL - 12融合基因插入 pc DNA3.1真核表达载体中 ,转染 COS- 7细胞表达 hsc IL - 12融合蛋白 ,并行 Western blot分析。结果该融合基因经 DNA序列分析表明 :p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确 ,融合基因可在 COS- 7细胞中表达hsc IL- 12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子量为 70 0 0 0 u,可与鼠抗人 IL- 12 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论重组 PCR技术是十分有效。 展开更多

关键词 重组PCR 人白细胞介素12 人单链白细胞介素 融合基因

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结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定 被引量：2

12

作者 赵勇 张海 +5 位作者 赵善民 伍静 毛峰峰 郭晓雅 张彩勤 师长宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期961-965,共5页

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基... 目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。 展开更多

关键词 HBHA hil-12 耻垢分枝杆菌 重组疫苗 融合蛋白

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人白细胞介素12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫增强对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果 被引量：1

13

作者 李晖 李强 +2 位作者 钟森 任红 黄永茂 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期839-844,共6页

本课题旨在研究结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.40只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、Mtb8.4基因疫苗组、卡... 本课题旨在研究结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.40只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次.BCG组经尾部皮下注射1×106CFUBCG免疫1次.免疫4周后,每组处死3只小鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性.每组其余5只小鼠用结核杆菌H37Rv强毒株经尾静脉攻击,4周后,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果显示,联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为1493±8pg/ml、748±49pg/ml),显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果,使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,优于Mtb8.4基因疫苗组.表明hIL-12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫后,能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高. 展开更多

关键词 结核病 MTB8.4 hil-12 联合免疫 细胞免疫应答 免疫保护

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人IL-12表达质粒联合含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果 被引量：1

14

作者 李晖 李榕 +1 位作者 钟森 任红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期291-294,共4页

目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗+hIL-12组)、MS基因疫苗组、... 目的研究结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠后,诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法将40只C57BL/6N小鼠随机分为联合免疫组(MS基因疫苗+hIL-12组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组。将基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次;BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次。采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞的杀伤活性。用结核杆菌强毒株H37Rv静脉攻击小鼠后,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数。对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,经ZN染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-2的水平,与BCG组相当,显著高于MS基因疫苗组,IL-4分泌减少,特异性CTL的杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果。表现为小鼠肺和脾组织中结核杆菌的菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗(BCG)组相当,但优于MS基因疫苗组。结论以hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能显著增强MS基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。 展开更多

关键词 含信号肽Mtb8.4(MS) hil-12 联合免疫 细胞免疫应答 小鼠

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重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达 被引量：1

15

作者 张梅 司履生 +1 位作者 王一理 耿宜苹 《西安医科大学学报》 CSCD 2000年第4期297-302,共6页

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1... 克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果　所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论　本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1 展开更多

关键词 重组人单链白细胞介素12 融合基因 真核表达

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人白介素-12(P40)亚基在巴斯德毕赤酵母中的表达

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作者 陈新华 杨林 +2 位作者 陈曲侯 王珣章 龙綮新 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期72-74,100,共4页

运用PCR技术特异性地扩增了人IL 1 2p4 0亚基cDNA的编码区序列 ,得到 94 0bp的扩增片段 ,将其克隆于毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPICZαC的ClaⅠ ,XbaⅠ位点 ,构建成重组表达质粒pPICZαC p4 0 .经LiCl2 转化 ,Zeocin抗性筛选 ,... 运用PCR技术特异性地扩增了人IL 1 2p4 0亚基cDNA的编码区序列 ,得到 94 0bp的扩增片段 ,将其克隆于毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPICZαC的ClaⅠ ,XbaⅠ位点 ,构建成重组表达质粒pPICZαC p4 0 .经LiCl2 转化 ,Zeocin抗性筛选 ,得到含多拷贝p4 0基因的酵母工程菌PichiapastorisX 3 3 /p4 0 ,在 φ =0 5%甲醇诱导下 ,p4 0基因得到了分泌型表达 ,培养上清的SDS PAGE及Western blot均显示表达产物相对分子质量约 4 40 0 0 ,与预计大小相符 ,薄层凝胶扫描结果表明 ,分泌型表达蛋白占培养上清总蛋白量质量的 4 7% . 展开更多

关键词 IL-12 P40亚基 表达 白介素-12 巴斯德毕赤酵母 PCR技术 免疫调节因子

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人IL-12基因表达对含信号肽mtb8.4基因疫苗的免疫效应

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作者 李晖 李榕 +2 位作者 钟森 任红 黄永茂 《现代预防医学》 CAS 北大核心 2007年第5期949-951,共3页

[目的]观察结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)表达质粒联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答。[方法]15只C57BL/6N小鼠随机分为MS基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体... [目的]观察结核分枝杆菌含信号肽Mtb8.4(MS)基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)表达质粒联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答。[方法]15只C57BL/6N小鼠随机分为MS基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组)、MS基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性。[结果]联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为(1546.18±36.23)pg/ml、(681.64±40.88)pg/ml),显著高于MS基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强。[结论]hIL-12表达质粒与MS基因疫苗联合免疫后,能够增强MS基因疫苗所诱导的细胞免疫应答。 展开更多

关键词 结核病 MS hil-12 联合免疫 细胞免疫应答

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HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用 被引量：2

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作者 侯沙沙 高燕 +6 位作者 王宇 武帅 朱晓明 郭炳冉 徐元基 阎瑾琦 于继云 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期921-924,共4页

目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名... 目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。 展开更多

关键词 乙型病毒性肝炎 免疫基因治疗剂 HBsAb靶向性干扰素 IFN-Α hil-12 真核表达

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人白细胞介素12在昆虫细胞中的表达 被引量：2

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作者 沈惠 李昌麟 +2 位作者 林明群 张宗梁 申庆祥 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第4期359-365,共7页

人白细胞介素１２（ｈＩＬ１２）是一种异源二聚体细胞因子，由ｐ４０和ｐ３５两个亚基通过二硫键连接而成。首先构建了两个表达载体ｐＶＬ１３９２ｈｐ４０和ｐＶＬ１３９３ｈｐ３５，并分别与线性化多角体病毒基因组ＤＮＡ共转... 人白细胞介素１２（ｈＩＬ１２）是一种异源二聚体细胞因子，由ｐ４０和ｐ３５两个亚基通过二硫键连接而成。首先构建了两个表达载体ｐＶＬ１３９２ｈｐ４０和ｐＶＬ１３９３ｈｐ３５，并分别与线性化多角体病毒基因组ＤＮＡ共转染昆虫细胞株Ｓｆ９，用目视法筛选出重组病毒ＡｃＮＰＶｈｐ４０和ＡｃＮＰＶｈｐ３５。利用ＰＨＡ激活的人淋巴细胞增殖试验，在条件培液中检测到重组ｈＩＬ１２的生物活性，表达量约为１５～２μｇ／１０６细胞。经实时ＢＩＡ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，ｈｐ３５和ｈｐ４０两亚基在昆虫细胞中获得表达。非还原条件下的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，重组ｈＩＬ１２的表观分子量为７６ｋＤａ，ｈｐ４０同源二聚体的表观分子量为９２ｋＤａ。重组ｐｈ４０具有明显抑制ｈＩＬ１２生物活性的作用。 展开更多

关键词 白细胞介素12 实时BIA 表达 昆虫细胞

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人白介素-12蛋白在人源骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及抗肿瘤活性研究

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作者 石艳红 李惊雷 《药物生物技术》 CAS 2018年第1期12-17,共6页

为研究人骨肉瘤细胞(U2-OS)表达人白介素12(hIL-12)的可行性,利用Lipofectamine 2 000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法及Western-Blot法检测人白介素(hIL-12)在细胞的表达,并对产物活性进行了验证。将hIL-12成熟肽... 为研究人骨肉瘤细胞(U2-OS)表达人白介素12(hIL-12)的可行性,利用Lipofectamine 2 000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法及Western-Blot法检测人白介素(hIL-12)在细胞的表达,并对产物活性进行了验证。将hIL-12成熟肽基因序列5'端添加Hind Ⅲ酶切位点,3'端添加6×His标签及Bam HI酶切位点,再将基因通过5'Hind Ⅲ和3'Bam HI克隆至载体pc DNA3.1上,最后转化大肠杆菌DH5α,挑取转化子并提取质粒进行酶切及测序验证。获得重组表达质粒pc DNA3.1-hIL-12,利用Lipofectamine 2 000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR法及Western-Blot法检测hIL-12的表达。High affinity Ni-charged resin纯化hIL-12,动物体内验证其抗肿瘤活性。实验研究显示,通过基因转染技术可以将hIL-12基因导入到人U2-OS细胞,组成hIL-12的人源表达系统,经验证,hIL-12基因在U2-OS细胞内表达相应蛋白。活性研究显示,荷瘤小鼠体内IFNγ水平显著升高,脾脏细胞毒T细胞(CTL)活性及自然杀伤性细胞(CK)活性均显著升高,肿瘤重量也明显降低。 展开更多

关键词 人源癌U2-OS细胞 hil-12 转染 肿瘤

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