The human CD81(hCD81),the most recently proposed receptor of hepatitis C virus(HCV),can especifically bind to HCV envelope glycoprotein 2(E2).In this study,hCD81-expressing murine NIH/3T3 cells were used to select hCD...The human CD81(hCD81),the most recently proposed receptor of hepatitis C virus(HCV),can especifically bind to HCV envelope glycoprotein 2(E2).In this study,hCD81-expressing murine NIH/3T3 cells were used to select hCD81-binding peptides from a phage displayed nonapeptide library(PVIII9aaCys).Eighteen of the 75clones selected from the library showed specific binding to the hCD81-expressing NIH/3T3 cells by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and competitive inhibition test.Twelve out of the 18 clones shared the amino acid motif SPQYWTGPA.Sequence comparison of the motif showed no amino acid homology with the native HCV E2.The motif-containing phages could competitively inhibit the ability of HCV E2 binding to native hCD81-expressing MOLT-4 cells,and induce HCV E2 specific immune response in vivo.These results suggest that the selected motif SPQYWTGPA should be a mimotope of HCV E2 to bind to hCD81 molecules.Our findings cast new light on developing HCV receptor antagonists.展开更多
目的建立一种快速的膜蛋白异源表达筛选方法,并验证重组蛋白细胞内定位及完整性。方法使用重叠PCR方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因与人CD81(h CD81)基因连接一起构成hCD81-GFP融合基因,重组基因克隆至pFastBac1载体上,使用昆虫细胞异源表...目的建立一种快速的膜蛋白异源表达筛选方法,并验证重组蛋白细胞内定位及完整性。方法使用重叠PCR方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因与人CD81(h CD81)基因连接一起构成hCD81-GFP融合基因,重组基因克隆至pFastBac1载体上,使用昆虫细胞异源表达重组基因。通过观察绿色荧光信号判断重组蛋白的表达及定位。纯化重组蛋白,通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析重组蛋白的大小。结果使用hCD81上游引物和GFP下游引物进行PCR扩增获得hCD81-GFP融合基因,在1000和2000 bp DNA Marker旁有一条带与融合基因hCD81-GFP大小近似。融合基因插入pFastBac1质粒后测序证明,插入的融合基因序列正确。分子排阻色谱及SDS-PAGE分析显示,hCD81与绿色荧光蛋白融合表达。荧光信号显示重组蛋白定位到细胞膜上,与hCD81分子的细胞定位一致。分子排阻色谱结果显示,重组蛋白的洗脱峰成高斯分布,提示纯化的重组蛋白分子体积均一。依据hCD81-GFP融合蛋白的洗脱体积16.859 mL计算出的重组蛋白分子量为58.34×10^(3)Mr,与重组蛋白的理论分子量56.10×10^(3)Mr近似;洗脱液的SDS-PAGE分析显示,重组蛋白条带与66.2×10^(3)Mr蛋白Marker位置近似。结论目标蛋白与绿色荧光蛋白连接,通过观察荧光信号,仅需少量的细胞培养即可判断重组蛋白是否表达。该方法可以加快重组蛋白的表达筛选。展开更多
基金supported by research grants from the National Natural Science Foundation of China(No.30271l87)the Shanghai Science and Technology Development Foundation(No.02DJ14015)
文摘The human CD81(hCD81),the most recently proposed receptor of hepatitis C virus(HCV),can especifically bind to HCV envelope glycoprotein 2(E2).In this study,hCD81-expressing murine NIH/3T3 cells were used to select hCD81-binding peptides from a phage displayed nonapeptide library(PVIII9aaCys).Eighteen of the 75clones selected from the library showed specific binding to the hCD81-expressing NIH/3T3 cells by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)and competitive inhibition test.Twelve out of the 18 clones shared the amino acid motif SPQYWTGPA.Sequence comparison of the motif showed no amino acid homology with the native HCV E2.The motif-containing phages could competitively inhibit the ability of HCV E2 binding to native hCD81-expressing MOLT-4 cells,and induce HCV E2 specific immune response in vivo.These results suggest that the selected motif SPQYWTGPA should be a mimotope of HCV E2 to bind to hCD81 molecules.Our findings cast new light on developing HCV receptor antagonists.
文摘目的建立一种快速的膜蛋白异源表达筛选方法,并验证重组蛋白细胞内定位及完整性。方法使用重叠PCR方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因与人CD81(h CD81)基因连接一起构成hCD81-GFP融合基因,重组基因克隆至pFastBac1载体上,使用昆虫细胞异源表达重组基因。通过观察绿色荧光信号判断重组蛋白的表达及定位。纯化重组蛋白,通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析重组蛋白的大小。结果使用hCD81上游引物和GFP下游引物进行PCR扩增获得hCD81-GFP融合基因,在1000和2000 bp DNA Marker旁有一条带与融合基因hCD81-GFP大小近似。融合基因插入pFastBac1质粒后测序证明,插入的融合基因序列正确。分子排阻色谱及SDS-PAGE分析显示,hCD81与绿色荧光蛋白融合表达。荧光信号显示重组蛋白定位到细胞膜上,与hCD81分子的细胞定位一致。分子排阻色谱结果显示,重组蛋白的洗脱峰成高斯分布,提示纯化的重组蛋白分子体积均一。依据hCD81-GFP融合蛋白的洗脱体积16.859 mL计算出的重组蛋白分子量为58.34×10^(3)Mr,与重组蛋白的理论分子量56.10×10^(3)Mr近似;洗脱液的SDS-PAGE分析显示,重组蛋白条带与66.2×10^(3)Mr蛋白Marker位置近似。结论目标蛋白与绿色荧光蛋白连接,通过观察荧光信号,仅需少量的细胞培养即可判断重组蛋白是否表达。该方法可以加快重组蛋白的表达筛选。
