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SFFV启动子高效驱动mCherry-GFP-LC3B双荧光体系在红系细胞中进行自噬检测
1
作者 任久强 李静 +2 位作者 李卓 刘雪会 吕湘 《基础医学与临床》 2025年第7期866-873,共8页
目的建立由造血细胞中高活性的脾焦点形成病毒(SFFV)启动子驱动的mCherry-GFP-LC3B慢病毒表达体系,并实现红系终末分化细胞自噬流的高效动态示踪。方法构建pRSC-SFFV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒质粒,包装慢病毒并感染人红系祖细胞系(HUDEP... 目的建立由造血细胞中高活性的脾焦点形成病毒(SFFV)启动子驱动的mCherry-GFP-LC3B慢病毒表达体系,并实现红系终末分化细胞自噬流的高效动态示踪。方法构建pRSC-SFFV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒质粒,包装慢病毒并感染人红系祖细胞系(HUDEP-2)及小鼠胎肝来源原代红系细胞;结合血清剥夺及氯喹干预模型,利用荧光成像、Western blot及流式细胞测量术分析红系终末分化细胞的自噬动态变化。结果SFFV启动子在HUDEP-2(97%vs.60%)及原代小鼠胎肝红系细胞(83%vs.1%)中表达的阳性率均显著高于巨噬细胞病毒(CMV)启动子(P<0.01,P<0.001),且不影响正常分化。血清剥夺后,自噬溶酶体(红斑)数量增加,伴随LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高及p62蛋白下降;氯喹干预则导致自噬体(黄斑)累积(P<0.001),且抑制效应呈剂量依赖性(r^(2)=0.92)。结论SFFV驱动双荧光体系可高效实时示踪红系细胞自噬流动态,为红系分化及相关贫血性疾病的机制研究提供了高灵敏度工具。 展开更多
关键词 SFFV启动子 自噬 mCherry-gfp-LC3B双荧光 红系细胞
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基于Split-GFP系统定量分析大肠杆菌中异源表达的类胶原蛋白Scl2
2
作者 色依德·斯马依 赵晨旭 +3 位作者 张轶群 刘业学 王稳航 李玉 《天津科技大学学报》 2025年第1期13-19,27,共8页
利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达类胶原蛋白Scl2,并通过Split-GFP系统建立一种简便、快速且可定量检测Scl2的方法。结果表明,Scl2在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,并通过His亲和标签纯化得到较高纯度的Scl2。圆二... 利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达类胶原蛋白Scl2,并通过Split-GFP系统建立一种简便、快速且可定量检测Scl2的方法。结果表明,Scl2在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达,并通过His亲和标签纯化得到较高纯度的Scl2。圆二色光谱和差示扫描量热仪分析发现,Scl2的二级结构和热稳定性与动物源Ⅰ型胶原蛋白相似,并且GFP11的融合对其几乎没有影响。GFP1-10和Scl2-GFP11结合的前20 h的结合速度较高,达到最大相对荧光强度需要约70 h。当两者结合1 h时,Scl2-GFP11蛋白质量浓度与相对荧光强度之间能够形成较好的线性关系,相关系数R2为0.9995,重复性良好。本研究利用Split-GFP系统建立了体外检测并定量分析Scl2的方法,为下一步高通量筛选研究提供了快速、简便的工具。 展开更多
关键词 大肠杆菌 异源表达 类胶原蛋白Scl2 Split-gfp 蛋白定量分析
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基因工程疟原虫P.bzoGFP的构建及其生物特性
3
作者 范长一 巩小惠 +3 位作者 魏延钊 张雨琦 王姗姗 杜峰 《济宁医学院学报》 2025年第1期12-18,共7页
目的构建动合子阶段表达绿色荧光蛋白的基因工程疟原虫,为该阶段相关的研究提供工具虫株。方法构建含有GFP基因序列和pb25基因位点重组同源臂的打靶载体,线性化后电转染至伯氏疟原虫P.berghei。经药物筛选后使用有限稀释法进行克隆,利用... 目的构建动合子阶段表达绿色荧光蛋白的基因工程疟原虫,为该阶段相关的研究提供工具虫株。方法构建含有GFP基因序列和pb25基因位点重组同源臂的打靶载体,线性化后电转染至伯氏疟原虫P.berghei。经药物筛选后使用有限稀释法进行克隆,利用PCR进行基因型鉴定。通过观察记录感染小鼠的发病情况、疟疾血症、红内期各阶段和合子、动合子的形态发育,分析基因工程疟原虫的生物学特性。结果基因工程伯氏疟原虫P.bzoGFP,经PCR基因型鉴定与预期一致,且能在动合子阶段表达绿色荧光蛋白。P.bzoGFP与野生型疟原虫在红细胞内的形态和体外培养合子、动合子的形态均无差异,感染小鼠的生存时间无统计学差异(χ^(2)=0.309,P>0.05),体外培养动合子的转化情况无显著差别(t=0.341,P>0.05)。结论成功构建基因工程疟原虫P.bzoGFP,其生物学特性与野生型疟原虫无明显不同,能够在合子形成后有效表达GFP,无需抗体标记,可直接用于疟疾传播阻断效果的评估等此阶段相关研究。 展开更多
关键词 疟疾 gfp 基因工程 动合子
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M细胞靶向融合肽SAM-GFP的原核表达、纯化及靶向性质鉴定
4
作者 吴静 张乐乐 +5 位作者 张富蕊 刘昆梅 李润乐 汤锋 刘菁 郭乐 《中国生物制品学杂志》 2025年第7期796-801,共6页
目的 原核表达M细胞靶向融合肽SAM-GFP,纯化后进行靶向性质鉴定,以期为M细胞靶向性幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。方法 采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)法合成GFP基因,克隆至载体pCzn1-SAM中,构建重组质... 目的 原核表达M细胞靶向融合肽SAM-GFP,纯化后进行靶向性质鉴定,以期为M细胞靶向性幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础。方法 采用基于PCR的精确合成(PCR-based accurate synthesis,PAS)法合成GFP基因,克隆至载体pCzn1-SAM中,构建重组质粒pCzn1-SAM-GFP。将重组质粒转化至感受态E.coli Arctic Express,经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,获得融合蛋白SAM-GFP,并进行12%SDS-PAGE、Western blot及荧光显微镜鉴定。利用小鼠回肠袢模型,通过免疫荧光染色法验证融合蛋白SAM-GFP的M细胞靶向性。结果 重组质粒pCzn1-SAMGFP经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。融合蛋白SAM-GFP相对分子质量约54 900,主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达94.5%,可与鼠抗6×His/GFP单克隆抗体特异性结合,荧光显微镜下可见绿色荧光。SAM-GFP能被小肠M细胞特异性摄取。结论 成功表达并纯化了具有M细胞靶向功能的融合蛋白SAM-GFP,为后续幽门螺杆菌口服疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 M细胞靶向肽 原核表达 融合蛋白
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利用绿色荧光蛋白GFP研究谷瘟病致病菌与谷子的互作
5
作者 杨佳怡 张嘉颖 +3 位作者 高鑫轩 李春晓 赵立群 刘晓彤 《河北师范大学学报(自然科学版)》 2025年第6期616-623,共8页
谷瘟病由梨胞菌属的谷梨孢菌(Pyricularia setariae)侵染引发,是一种暴发式的谷子流行性真菌病害.近年来随着气候变化和推广的谷子品种抗病性变差,谷瘟病已成为危害谷子生产的主要病害,严重威胁谷子的产量和质量.因此,明确谷梨孢菌与谷... 谷瘟病由梨胞菌属的谷梨孢菌(Pyricularia setariae)侵染引发,是一种暴发式的谷子流行性真菌病害.近年来随着气候变化和推广的谷子品种抗病性变差,谷瘟病已成为危害谷子生产的主要病害,严重威胁谷子的产量和质量.因此,明确谷梨孢菌与谷子的互作过程,对防控谷瘟病具有重要意义.利用谷瘟病致病菌株HEB07构建了表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的HEB07重组菌株.借助激光共聚焦显微成像技术,在488 nm激光激发条件下,对HEB07重组菌株的侵染过程进行了动态观测.实验结果显示,该菌株的侵染过程呈现明显的时序性特征:初期(0~12h)可观察到分生孢子在寄主表面萌发并形成具有侵染功能的附着胞;中期(12~24h)附着胞分化产生侵染钉,随后通过菌丝顶端极性生长在植物组织内扩展:后期(24h之后)菌丝网络逐步建立,最终导致典型病斑的形成,该研究成果能够为谷子抗病分子机制探究以及抗病品种的选育工作提供基础数据。 展开更多
关键词 谷子 谷瘟病菌 绿色荧光蛋白 作物抗病
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GFP拆分方法示踪幽门螺杆菌CagA的转运研究 被引量：1
6
作者 吴倩文 刘书振 +7 位作者 张建辉 曹新颖 孙泽坤 贾钰刚 张莹 李波清 赵慧琳 季晓飞 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第5期502-506,513,共6页
目的用GFP拆分方法示踪幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染过程中CagA向胃上皮细胞内的转运过程。方法(1)PCR扩增CagA基因的上下游同源臂,连入敲除质粒pSJHK4中,将质粒通过电击转化的方法转入Hp中,利用卡那霉素筛选CagA敲除突变株... 目的用GFP拆分方法示踪幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染过程中CagA向胃上皮细胞内的转运过程。方法(1)PCR扩增CagA基因的上下游同源臂,连入敲除质粒pSJHK4中,将质粒通过电击转化的方法转入Hp中,利用卡那霉素筛选CagA敲除突变株ΔCagA。(2)PCR扩增绿色荧光蛋白GFP第11β折叠(GFP11)的基因序列并与CagA基因序列的3′端相连,将融合序列连入Hp-大肠埃希菌穿梭质粒pCHFHp中,并通过电击转化的方法转入ΔCagA中,利用氯霉素筛选CagA与GFP-11的融合表达突变株。(3)PCR扩增GFP第1-10β折叠(GFP1-10)的基因序列,包装慢病毒,利用病毒感染的方法将其转入胃上皮细胞GES-1中。将(2)中构建的Hp突变株以100∶1的感染复数感染(3)构建的表达GFP(1-10)的GES-1细胞体系,利用荧光显微镜观察细胞内的荧光情况,通过Western blot检测细胞内的CagA蛋白含量。结果构建了CagA敲除质粒pSJHK4-cagA,转入Hp中得到CagA敲除突变株ΔCagA。构建了CagA与GFP-11的融合表达质粒pCHFHp-cagAgfp11,转入ΔCagA中获得CagA与GFP-11的融合表达突变株HpG27-cagAgfp11。构建了含有GFP1-10基因序列的慢病毒,感染GES-1细胞后获得GFP1-10稳定表达的细胞株。在HpG27-cagAgfp11感染GES-1模型中,观察到细胞中的绿色荧光,说明CagA被转运到GES-1细胞内部,其融合表达的GFP-11与细胞内表达的GFP1-10结合发出荧光,Western blot结果也证实CagA被转运至胞内。结论在Hp感染GES-1细胞模型中,GFP拆分方法能够示踪CagA向细胞的转运过程,这为CagA的转运研究提供了新方法,有助于HpIV型分泌系统(T4SS)作用机制的深入研究。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 CAGA gfp拆分 T4SS
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绿色荧光蛋白(GFP)标记杧果细菌性角斑病病原菌及其定殖规律 被引量：1
7
作者 於浩然 吴婧波 +4 位作者 詹儒林 柳凤 姚全胜 李国平 魏卿 《中国南方果树》 北大核心 2024年第4期71-79,共9页
为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定... 为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定,成功获得带绿色荧光蛋白(GFP)标记的转化子Xcm003-EGFP,采用室内刺伤和盆栽苗灌根接种试验,结合组织学观察法,追踪该病原菌在不同杧果器官组织中的定殖规律。结果表明,病原菌通过伤口侵入杧果果实果皮外层细胞层,随着侵染时间推移,向内层果皮细胞层垂直扩散并定殖,后期病原菌在伤口处大量聚集,出现隆起开裂状病斑。在杧果叶片中,病原菌从伤口侵入叶片上表皮细胞层,随后迁移到叶肉细胞间隙,侵染后期,病原菌在气孔和伤口定殖,造成气孔和伤口堵塞,导致接种点出现黑褐色水浸病斑。盆栽苗灌根后发现,该病原菌可在土壤中定殖,入侵杧果根部,但并不扩散至其他杧果组织,不会为害整株幼苗。说明杧果细菌性角斑病病菌可在不同杧果组织中定殖,但仅表现为局部侵染特性。 展开更多
关键词 杧果细菌性角斑病 野油菜黄单胞菌杧果致病变种Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae gfp标记 质粒 定殖
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面向视频侦查应用的退化人像GFP深度复原技术 被引量：1
8
作者 倪新龙 孙鹏 +3 位作者 郎宇博 赵理夫 田天泽 周纯冰 《刑事技术》 2024年第2期111-119,共9页
在视频侦查工作中时常遇到视频人像质量过低难以辨识的情况,而GFP等人像深度复原方法只适用于单张人像的复原。为此,本文提出一种基于GFP的监控视频人像复原技术,将GFP方法扩展至视频侦查应用,便于及时锁定犯罪嫌疑人,提高破案效率。首... 在视频侦查工作中时常遇到视频人像质量过低难以辨识的情况,而GFP等人像深度复原方法只适用于单张人像的复原。为此,本文提出一种基于GFP的监控视频人像复原技术,将GFP方法扩展至视频侦查应用,便于及时锁定犯罪嫌疑人,提高破案效率。首先对监控视频进行视频分帧、人像裁剪对齐、倾斜透视校正等预处理操作,然后使用GFP方法对预处理后得到的人像进行深度复原,最后经过逆处理将复原人像整合成高质量人像视频。在大量经过预处理后的模拟退化人像和无参考退化人像测试集上进行对比实验,结果表明,GFP方法在主观视觉效果和FID、PSFR、SSIM、NIQE等客观量化指标上均优于其他人像深度复原方法,相较于其他人像深度复原方法,能够更有效地复原复杂应用场景下的低质量退化人像,更适用于视频侦查应用;通过使用YTF视频人像数据集进行对比测试实验,结果显示,本文所提出的添加预处理与逆处理过程的基于GFP的监控视频人像复原技术,对于低质量视频人像有更加优秀的复原效果。 展开更多
关键词 视频侦查 监控视频 人像复原 视频分帧 倾斜透视校正 gfp
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基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株 被引量：2
9
作者 谢钰珍 覃鸿妮 +2 位作者 吴凡 孙曙光 孟丽君 《山东理工大学学报（自然科学版）》 2024年第2期67-72,共6页
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成... 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。 展开更多
关键词 PD-L1 CRISPR/Cas9 报告基因 gfp
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生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性 被引量：15
10
作者 张昕 张炳欣 +4 位作者 喻景权 张震 沈卫峰 陈振宇 石江 《应用生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第11期2144-2148,共5页
将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围... 将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖. 展开更多
关键词 质粒pRP22-gfp gfp基因 短短芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 黄瓜根围 定殖
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花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米 被引量：6
11
作者 王秀红 白建荣 +3 位作者 孙毅 刘惠民 史向远 任志强 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1732-1737,共6页
利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率... 利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达. 展开更多
关键词 玉米自交系 花粉介导转基因法 TaPHR1∷gfp融合蛋白基因 gfp(绿色荧光蛋白)
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慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响 被引量：3
12
作者 李燕 陆伟 +4 位作者 竺丽梅 邵燕 陈诚 刘巧 韩晓冬 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期883-889,共7页
运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁... 运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响. 展开更多
关键词 慢病毒(Lentivirus) 绿色荧光蛋白(gfp) 小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 转染 组织工程 green fluorescent protein (gfp) MESENCHYMAL stem cells (MSC)
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nptⅡ::mgfp5融合基因的构建及其在柑桔遗传转化中的应用 被引量：2
13
作者 刘小丰 彭爱红 +4 位作者 许兰珍 邹修平 朱世平 赵晓春 陈善春 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2013年第7期1282-1287,共6页
早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸... 早期、无损伤、易于操作的阳性芽检测技术,对提高柑橘遗传转化效率是十分有利的。本文设计和构建了nptⅡ：：mgfp5融合基因,通过锦橙上胚轴转化体系研究其在柑橘遗传转化中的作用。nptⅡ：：mgfp5融合基因全长1 578 bp,编码525个氨基酸,作为表达载体p1301NG的选择标记和报告基因。通过农杆菌介导法转化锦橙上胚轴,再生培养1周后用体式荧光显微镜观察外植体的再生情况。在再生培养第9天时即观察到GFP荧光再生芽的形成,再生培养后10~15 d是GFP再生芽形成的高峰期。GUS染色和PCR分子检测结果证明,GFP荧光检测结果是真实可靠的。研究结果表明：nptⅡ：：mgfp5融合基因能够在再生培养早期筛选到阳性转化芽,有助于提高阳性转化芽的存活率,提高柑橘遗传转化效率。 展开更多
关键词 nptⅡ mgfp5融合基因 柑橘遗传转化 gfp荧光 转化效率
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伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建 被引量：2
14
作者 姜焱 侯玉峰 陈溥言 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期15-20,共6页
在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部... 在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒上海株 PRV-SH gE^-/gI^-/gfp^+缺失株 构建 转移载体质粒 绿色荧光蛋白(gfp)表达盒
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绿色荧光蛋白(GFP)在分子遗传学上的研究进展 被引量：4
15
作者 杨秀芹 刘娣 祖延涛 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2001年第7期36-38,共3页
作为一种新型、方便的报告基因 ,来自多管水母属的绿色荧光蛋白 (GFP)具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时 ,能够发出明亮的绿色荧光 ,且这种荧光不需要外源底物和辅因子 ,因此 ,它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和... 作为一种新型、方便的报告基因 ,来自多管水母属的绿色荧光蛋白 (GFP)具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时 ,能够发出明亮的绿色荧光 ,且这种荧光不需要外源底物和辅因子 ,因此 ,它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和蛋白质定位 。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 gfp gfp突变体 分子遗传学 报告基因 应用
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GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响
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作者 时兰春 王伯初 +2 位作者 杨兴艳 张运刚 王益川 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期931-939,共9页
以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥... 以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥种子的出愈量减少为野生型的59%、悬浮细胞的长短轴比缩小为1.20±0.21、第7天细胞活力下降为0.66±0.09,影响细胞的生长曲线.(2)GFP-FABD标记蛋白虽对愈伤生长影响不大,但却使悬浮细胞的长短轴比显著增加为2.49±1.18、第7天细胞的活力下降为0.87±0.06,造成悬浮细胞生长曲线的改变.(3)通过调整培养条件的激素水平,以上两种细胞骨架标记蛋白对悬浮细胞生长的影响可以得到修复.(4)检测优化条件下培养的GFP-FABD2或GFP-MBD悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力,结果未发现与野生型有明显区别. 展开更多
关键词 gfp-FABD2 gfp-MBD 拟南芥 悬浮细胞 应激响应
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鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究
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作者 孙丽翠 贺俊崎 +6 位作者 郑君芳 王雅梅 张松 张玉国 仲飞 刘朋朋 齐顺章 《首都医科大学学报》 CAS 2007年第4期479-483,共5页
目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MA... 目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR。采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量。结果荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%。结论该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量。 展开更多
关键词 PCR 鸡α-珠蛋白基因5'端MAR pgfp/2MAR gfp 流式细胞仪
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GFP标记的球孢白僵菌在玉米中的定殖 被引量：19
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作者 隋丽 徐文静 +7 位作者 张正坤 杨芷 王志慧 杜茜 汪洋洲 陈日曌 李启云 路杨 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期848-857,共10页
为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接... 为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接种方式在球孢白僵菌不同处理浓度下对玉米生长指标的影响。结果表明,球孢白僵菌在玉米不同组织部位上的定殖有着明显的差异,各球孢白僵菌接种处理中,均以叶部定殖的白僵菌孢子数最多,而茎部均未观测到孢子定殖;玉米根部仅在浸种和灌根处理中可见少量孢子。球孢白僵菌不同接种方式对其在玉米中定殖率的影响差异较大,灌根处理定殖率最高,为76.7%;其次为浸种处理,为73.3%;茎部注射处理及叶面喷施处理定殖率较低,分别为43.3%和36.7%。研究表明,不同施用方式及接种浓度球孢白僵菌孢悬液对玉米生长指标有一定的影响,球孢白僵菌可通过不同接种方式在玉米植株中定殖并扩散,对玉米的生长发育有一定的促进作用,其中以1×106～1×107孢子/mL球孢白僵菌孢悬液浸种或灌根,对玉米苗的促进生长作用最明显。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白(gfp) 球孢白僵菌 玉米 定殖
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GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究 被引量：16
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作者 朱道圩 米银法 +2 位作者 陈延惠 王静毅 刘中杰 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2003年第2期145-148,共4页
用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、... 用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂. 展开更多
关键词 软枣猕猴桃 愈伤组织 原生质体 瞬间表达 gfp基因 PEG介导法 遗传转化 绿色荧光蛋白 报告基因
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利用GFP和抗性双类型标记监测联合固氮菌在玉米根际的定殖 被引量：12
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作者 董越梅 安千里 +1 位作者 李久蒂 朱至清 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 2000年第1期61-65,共5页
将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有... 将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有抗生素抗性又在蓝光下呈现亮绿荧光的菌株 .用它们接种玉米后 ,利用这两种选择标记双重筛选重新分离到的细菌确定了接种菌在玉米幼苗根表面的定殖数目 ,同时用荧光显微镜观测了它们在玉米根表和土壤中的分布 .确证了GFP与抗生素抗性双标记定量环境中微生物的可靠性和GFP标记用于原位监测细菌分布的优越性 .图版 1图 1表 2参 展开更多
关键词 联合固氮菌 工程菌监测 gfp 抗性 双标记基因
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