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EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体构建及基因编辑效果验证
1
作者 陈博雯 肖玉菲 +4 位作者 李军集 钟连香 魏秋兰 覃子海 刘海龙 《分子植物育种》 北大核心 2025年第7期2226-2231,共6页
为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使... 为了对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)木质素合成关键基因开展基因编辑研究,本研究构建了Eu-CAD基因的CRISPR/Cas9敲除载体,并利用原生质体转化体系对基因编辑效果进行验证。对EuCAD基因序列进行分析,设计两条位于外显子的靶位点序列,使用Golden Gate技术构建得到基因编辑载体pRGEB35-CAD。以尾叶桉继代苗茎尖为材料建立原生质体转化体系,用pGFP质粒进行转化,依据GFP荧光激发结果统计体系的转化率为2.47%。将pRGEB35-CAD转化至原生质体,PCR鉴定显示在原生质体中EuCAD发生了预期的基因编辑,pRGEB35-CAD取得了预期基因编辑效果。本研究构建的EuCAD基因CRISPR/Cas9敲除载体可对目标基因进行基因编辑,为进一步创制EuCAD敲除突变体奠定了研究基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9敲除载体 原生质体转化 CAD基因 尾叶桉
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大肠杆菌胞质非特异性二肽酶对γ-氨基丁酸的催化作用研究 被引量：1
2
作者 张一维 崔文璟 +1 位作者 周哲敏 刘中美 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期139-144,共6页
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)广泛应用于食品和医药等领域,目前主要利用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主菌,由酶催化方法生产。在全细胞转化过程中,GABA会进入三羧酸循环进行降解,导致转化率低下;通过敲基因阻碍此途径... γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)广泛应用于食品和医药等领域,目前主要利用大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主菌,由酶催化方法生产。在全细胞转化过程中,GABA会进入三羧酸循环进行降解,导致转化率低下;通过敲基因阻碍此途径又会严重影响宿主菌的生长。该研究揭示了一条新的GABA的消耗途径:GABA在胞质非特异性二肽酶(cytosolic nonspecific dipeptidase,pepD)的作用下缩合形成二肽。该文构建了2个工程菌株:敲除E.coli BL21(DE3)基因组上的pepD基因,构建了ΔpepD菌株;在E.coli BL21(DE3)中过表达了pepD基因,构建了OE pepD菌株。以GABA和谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)为底物,进行全细胞转化反应。结果表明,该酶不能催化MSG发生反应,但是能催化GABA发生反应。通过研究2个菌株消耗GABA的历程,发现OE pepD的GABA消耗量比ΔpepD菌株高出17.5%,消耗量在2 h之后都不再增加。利用LC-MS鉴定纯酶催化反应的产物,证实产物是GABA形成的二肽。该研究构建的菌株可以在不影响大肠杆菌生长的情况下有效提高GABA的产量,为GABA的工业化生产提供有益参考。 展开更多
关键词 Γ-氨基丁酸 胞质非特异性二肽酶 基因敲除
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小麦TaMBD9基因敲除及其对叶夹角的影响 被引量：2
3
作者 范姗姗 杜金强 +3 位作者 张新宁 吴玉杰 孟凡荣 李永春 《河南农业大学学报》 北大核心 2025年第1期29-37,共9页
【目的】创建小麦TaMBD9基因敲除材料,探讨该基因在小麦生长发育调控过程中的生物学功能。【方法】利用实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析TaMBD9的表达特性,通过C... 【目的】创建小麦TaMBD9基因敲除材料,探讨该基因在小麦生长发育调控过程中的生物学功能。【方法】利用实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析TaMBD9的表达特性,通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术创建基因敲除小麦材料。【结果】表达分析显示,TaMBD9在小麦不同组织间存在差异表达,其中叶片中的表达量最高,且随发育进程有所波动。3个部分同源基因间表达水平存在一定差异,其中TaMBD9D的表达水平较高。获得了TaMBD9的3个部分同源基因均成功敲除的纯合突变小麦材料。表型分析发现,TaMBD9敲除导致小麦叶夹角明显增大。【结论】小麦TaMBD9在叶夹角调控过程中发挥重要功能。研究获得了TaMBD9基因敲除纯合株系,为开展小麦叶夹角分子调控机制研究提供了新材料。 展开更多
关键词 小麦 叶夹角 TaMBD9基因 基因敲除 表达模式
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CRISPR/Cas9介导的doublesex基因敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形 被引量：1
4
作者 张浩楠 顾俊文 +3 位作者 张昕达 魏巍 康秋阁 张琪 《昆虫学报》 北大核心 2025年第6期720-727,共8页
【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域... 【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda双性基因doublesex(Sfdsx)单靶点敲除,旨在探究Sfdsx对草地贪夜蛾雄成虫翅发育的影响。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对草地贪夜蛾胚胎Sfdsx雌雄共有区域进行敲除,构建Sfdsx突变体;待化蛹后,在显微镜下观察草地贪夜蛾Sfdsx突变体蛹及成虫翅的形态特征差异。【结果】草地贪夜蛾Sfdsx突变体出现显著的性别比趋于雄性(雌∶雄=0∶14),位于腹部第8-9节的雄蛹生殖孔两侧发生严重扭曲;雄成虫突变体的翅性状趋向性别中间态,其中,前翅中央的肾形斑变形、翅末端黑斑消失、翅鳞片排列错乱。后翅翅展畸形,翅鳞片排列发生改变,着生小黑斑。【结论】CRISPR/Cas9介导的Sfdsx基因公共区域的敲除导致草地贪夜蛾雄成虫翅发育畸形。本研究的结果为利用昆虫不育技术(sterile insect technology,SIT)调控草地贪夜蛾的发育提供了理想的基因靶标和理论依据。 展开更多
关键词 草地贪夜蛾 基因敲除 CRISPR/Cas9 DOUBLESEX 翅发育
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肝脏特异性LCMT1基因敲除对小鼠糖脂代谢和学习记忆的影响 被引量：1
5
作者 陈思宏 唐婷婷 +11 位作者 蔡海青 王新航 王名鸿 彭阳 张敏华 韦美方 朱聪睿 张静 李晓莹 陆彩玲 唐深 李习艺 《广西医科大学学报》 2025年第1期23-30,共8页
目的:探讨肝脏特异性亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)基因敲除对小鼠糖脂代谢和学习记忆的影响及可能机制。方法:选取8周龄的雄性野生型(WT)小鼠和肝脏特异性LCMT1基因敲除(L-LCMT1KO)小鼠,普食饲养至16周龄,每组10只,记录小鼠的饮食情况... 目的:探讨肝脏特异性亮氨酸羧基甲基转移酶1(LCMT1)基因敲除对小鼠糖脂代谢和学习记忆的影响及可能机制。方法:选取8周龄的雄性野生型(WT)小鼠和肝脏特异性LCMT1基因敲除(L-LCMT1KO)小鼠,普食饲养至16周龄,每组10只,记录小鼠的饮食情况和体重变化。通过实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(western blotting)实验比较两组小鼠肝脏LCMT1基因和蛋白的表达情况;收集小鼠肝脏组织,苏木精—伊红染色(HE染色)观察肝脏组织形态。在16周龄时用疲劳转棒实验和Morris水迷宫实验分析两组小鼠的运动能力和空间学习记忆能力。检测空腹血糖水平,葡萄糖耐量实验观察糖代谢情况;称量小鼠的皮下脂肪和内脏脂肪,比较两组小鼠的脂肪重量;全自动生化分析仪检测血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平,比较两组小鼠的血脂代谢情况;RT-qPCR检测肝脏PPAR-α、SREBP-1c、Abca1、LDLR基因表达。结果:与WT小鼠相比,L-LCMT1KO小鼠的饮水量、进食量、能量摄入及体重差异无统计学意义(P>0.05)。L-LCMT1KO小鼠肝脏LCMT1的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)。肝脏HE染色和血清肝功能结果显示,与WT小鼠相比,肝脏LCMT1敲除对肝脏组织形态和血清AST、ALT水平无影响(P>0.05),不损害肝功能。行为学结果显示,与WT小鼠相比,肝脏LCMT1敲除不会引起小鼠运动和平衡能力的障碍(P>0.05),且可增强学习记忆能力(P<0.05)。糖代谢结果显示,L-LCMT1KO小鼠保持正常血糖水平和葡萄糖耐量(P>0.05);脂代谢结果显示,与WT小鼠相比,L-LCMT1KO小鼠皮下脂肪含量、内脏脂肪含量、TG水平及LDL-c水平无变化(P>0.05),而TC水平和HDL-c水平升高(P<0.05),TG/HDL-c比值降低(P<0.05),脂肪生成因子SREBP-1c表达下降(P<0.05)。结论:L-LCMT1KO对小鼠的血糖调节和脂肪含量没有显著影响,但可增强其学习记忆能力,肝脏特异性LCMT1基因敲除可能通过上调HDL-c水平并下调肝脏SREBP-1c表达,从而调控胆固醇代谢途径,进而影响学习记忆能力。 展开更多
关键词 肝 LCMT1 基因敲除 糖脂代谢 学习记忆
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基于CRISPR/Cas9系统构建Uox基因敲除的高尿酸血症小鼠模型
6
作者 张艺薇 龙维虎 +6 位作者 唐东红 范胜涛 王鹏 王陈芸 李哲丽 黄璋琼 叶尤松 《中国实验动物学报》 北大核心 2025年第3期411-419,共9页
目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Uox基因敲除且能稳定遗传的小鼠品系,并评价其是否能够模拟高尿酸血症患者的疾病特点。方法 在Uox基因Exon 2~4的前后两侧设计双sgRNA,将基因敲除所需的sgRNA与Cas9 mRNA按照一定比例显微注射进小鼠的受精... 目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Uox基因敲除且能稳定遗传的小鼠品系,并评价其是否能够模拟高尿酸血症患者的疾病特点。方法 在Uox基因Exon 2~4的前后两侧设计双sgRNA,将基因敲除所需的sgRNA与Cas9 mRNA按照一定比例显微注射进小鼠的受精卵中,培养2~4 h后,将胚胎移植至代孕母鼠体内并最终获得F0代小鼠。对F0代小鼠进行PCR鉴定与测序分析,筛选适合的Uox基因阳性敲除小鼠与野生型(wide type, WT)小鼠合笼获得F1代,再挑选F1代中杂合子(基因型为Uox^(+/-))雌鼠与雄鼠合笼得到纯合的F2代小鼠(基因型为Uox^(-/-))。最后检测Uox^(-/-)小鼠与WT小鼠血清尿酸、尿液尿酸,血清中肌酐、尿素、丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶的含量并进行对比,通过苏木素-伊红(HE)染色结合Masson染色观察肾和肝组织的病理变化。结果 与WT小鼠相比,Uox^(-/-)小鼠血清尿酸(雄鼠:(478.4±114.6)μmol/L,P<0.001;雌鼠:(507.7±129.6)μmol/L,P<0.001)、尿液尿酸(雄鼠:(4116.8±1928.1)μmol/L,P<0.001;雌鼠:(2998.0±547.7)μmol/L,P<0.01)、血清中肌酐((91.8±55.6)μmol/L,P<0.001)、尿素((28.6±13.9) mmol/L,P<0.05)、丙氨酸氨基转移酶((53.3±23.3) U/L,P<0.01)及门冬氨酸氨基转移酶((203.3±70.3) U/L,P<0.001)水平均显著升高。组织病理学的结果显示,Uox^(-/-)小鼠的肝中可见中量肝细胞变性,肾中可见中重度的肾小管囊性扩张、变性和纤维化,肾小球肥大增生,小血管扩张充血,间质单核及淋巴细胞浸润。结论 通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Uox基因Exon 2敲除的小鼠纯合品系,可以作为高尿酸领域相关研究的动物模型。 展开更多
关键词 高尿酸血症 动物模型 CRISPR/Cas9 基因敲除 尿酸氧化酶
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巴贝斯虫TRAP基因敲除虫株的构建及鉴定
7
作者 叶雨欣 王锦明 +7 位作者 年月丽 刘泽恩 梁勤东 张玉婷 拜娅楠 刘培琪 殷宏 关贵全 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第9期1227-1232,共6页
为阐明巴贝斯虫TRAP在入侵宿主细胞中的作用,采用同源重组技术敲除羊巴贝斯虫未定种新疆株的TRAP基因,通过PCR、间接免疫荧光及Western-blot等方法进行验证。结果显示,羊巴贝斯虫未定种新疆株的TRAP基因被成功敲除,这为靶向TRAP的药物... 为阐明巴贝斯虫TRAP在入侵宿主细胞中的作用,采用同源重组技术敲除羊巴贝斯虫未定种新疆株的TRAP基因,通过PCR、间接免疫荧光及Western-blot等方法进行验证。结果显示,羊巴贝斯虫未定种新疆株的TRAP基因被成功敲除,这为靶向TRAP的药物及疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 巴贝斯虫 TRAP基因 基因敲除 入侵
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nup155基因敲除的PK-15细胞系
8
作者 孙瑜嘉 殷娟斌 +6 位作者 刘瀛 李可卿 曹轶梅 朵红 卢曾军 赵志荀 张强 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期569-576,共8页
本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株,并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA,与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装;再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选细胞... 本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株,并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sg RNA,与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装;再使用2μg/m L嘌呤霉素筛选细胞株;通过RT-qPCR和Western-blot来确认细胞中Nup155基因是否被敲除;最终通过CCK8试验检测Nup155基因敲除对PK-15细胞活性的影响。RT-qPCR及Westernblot结果显示,细胞株Nup155基因的m RNA和蛋白表达水平显著降低;CCK8试验结果显示,部分敲除Nup155基因的PK-15细胞活力下降。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1株Nup155基因部分敲除的PK-15细胞系,并发现部分敲除Nup155基因会显著影响PK-15细胞活力,为深入研究Nup155基因的功能机制提供了理想的细胞模型。 展开更多
关键词 PK-15细胞 基因敲除 Nup155 慢病毒包装
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基于CRISPR/Cas9核蛋白复合体的芳香镰孢菌基因敲除体系
9
作者 赵璟琛 商文静 +2 位作者 曹燕霞 范三红 胡小平 《菌物学报》 北大核心 2025年第8期105-115,共11页
作为植物病原或植物内生真菌,芳香镰孢菌Fusarium redolens的基础生物学研究时有报道,但该菌的基因编辑和遗传转化体系研究尚未见报道。本研究以YP04菌株为对象,建立了基于CRISPR/Cas9核蛋白复合体的芳香镰孢菌遗传转化体系。首先建立... 作为植物病原或植物内生真菌,芳香镰孢菌Fusarium redolens的基础生物学研究时有报道,但该菌的基因编辑和遗传转化体系研究尚未见报道。本研究以YP04菌株为对象,建立了基于CRISPR/Cas9核蛋白复合体的芳香镰孢菌遗传转化体系。首先建立了优化的原生质体制备方法;随后以白僵菌素合成相关基因c18.1_Beas和c18.1_Bea3为靶标设计并制备Cas9/gRNA核蛋白(RNP)复合体;最后将RNP和含潮霉素抗性基因(hyg)的供体DNA共转化原生质体,通过潮霉素抗性筛选及PCR鉴定获得原位敲除突变体。单独转化供体DNA时Δc18.1_Bea3敲除突变体占抗性转化子的5.56%,而共转化RNP和供体DNA时Δc18.1_Beas和Δc18.1_Bea3敲除突变体分别占抗性转化子的22.22%和25.00%。HPLC分析结果显示野生型YP04及敲除突变体Δc18.1_Beas和Δc18.1_Bea3菌株合成白僵菌素的产率分别为169.25、30.00和285.22 mg/L。本研究建立的基因编辑体系可应用于芳香镰孢菌中各种致病及次生代谢基因功能的解析。 展开更多
关键词 芳香镰孢菌 CRISPR/Cas9核蛋白复合体 原生质体 基因敲除 白僵菌素
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白斑狗鱼zpax4基因表达分析及其敲除模型的建立
10
作者 刘璎慧 蒋丽 +6 位作者 雷静 刘祎 王顺哲 杨倩 孙浩然 范静 张俊杰 《南方农业学报》 北大核心 2025年第6期1715-1728,共14页
【目的】探究ZP基因家族中zpax4基因在白斑狗鱼性腺生长发育中的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型,为后续探究其生物学功能提供参考依据。【方法】利用RACE克隆白斑狗鱼zpax4基因的全长cDNA序列,利用生物信... 【目的】探究ZP基因家族中zpax4基因在白斑狗鱼性腺生长发育中的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型,为后续探究其生物学功能提供参考依据。【方法】利用RACE克隆白斑狗鱼zpax4基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件进行zpax4蛋白理化性质、结构特点和系统进化分析;应用实时荧光定量PCR分析zpax4基因在白斑狗鱼126、180和320 d 3个时期8个组织中的相对表达量;设计并筛选合适的sgRNA,通过对受精卵的显微注射,建立白斑狗鱼zpax4基因的CRISPR/Cas9敲除模型,并对获得的F_0代敲除嵌合体进行组织切片观察。【结果】白斑狗鱼zpax4基因c DNA全长2771 bp,其中,5'非编码区(5'-UTR)为162 bp,3'非编码区(3'-UTR)为150 bp。zpax4基因编码811个氨基酸残基,蛋白分子式C_(4117)H_(6364)N_(1092)O_(1209)S_(39),理论分子量为91.752 kD,理论等电点(pI)为5.43,且编码蛋白N端有信号肽序列,靠近C端有ZP结构域,无跨膜结构域,其二级结构由α-螺旋(14.3%)、无规则卷曲(54.5%)和延伸链(31.2%)构成。多序列比对和系统发育树分析显示,白斑狗鱼zpax4蛋白与其他几种鱼类的zpax4蛋白氨基酸序列相似性为54.85%,功能结构域位置相对保守。实时荧光定量PCR检测结果显示,白斑狗鱼zpax4基因在肠道、肌肉、鳃、头肾、肾脏、肝脏和精巢中基本无表达,而在3个时期的卵巢中均呈极显著表达(P<0.01),且卵巢中相对表达量在126、180和320 d 3个时期呈先增后减的变化趋势,180 d相对表达量最高;此外,在320 d雄鱼的脑组织中也有一定量的表达。利用CRISPR/Cas9技术筛选得到合适的sgRNA,并成功建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型,得到多种突变类型个体,缺失碱基数分别为1、4、7和8,均不为3的倍数。对F_0代嵌合体鱼苗进行整鱼切片分析,并未发现明显的性腺及其他部位的表型异常。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对白斑狗鱼zpax4基因进行敲除,成功构建了敲除模型,获得白斑狗鱼zpax4基因敲除嵌合体,并筛选出更优的sgRNA靶点序列。zpax4基因可能在白斑狗鱼卵巢发育的前中期发挥重要作用。 展开更多
关键词 白斑狗鱼 zpax4基因 表达特征 基因敲除 CRISPR/Cas9
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髓系特异性核因子ⅠB条件性基因敲除小鼠的构建及其肠道炎症表现
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作者 胡漫秋 周黎 +4 位作者 陈思源 刘宏韬 张浩 何松 周智航 《海军军医大学学报》 北大核心 2025年第2期215-222,共8页
目的通过构建核因子ⅠB(NFIB)条件性基因敲除(cKO)小鼠,探讨髓系细胞NFIB的表达与肠道炎症的关系。方法利用人类蛋白质图谱数据库、基因型-组织表达数据库和FANTOM5数据库查找NFIB在炎症细胞中的表达情况。运用CRISPR/Cas9技术构建NFIB-... 目的通过构建核因子ⅠB(NFIB)条件性基因敲除(cKO)小鼠,探讨髓系细胞NFIB的表达与肠道炎症的关系。方法利用人类蛋白质图谱数据库、基因型-组织表达数据库和FANTOM5数据库查找NFIB在炎症细胞中的表达情况。运用CRISPR/Cas9技术构建NFIB-flox小鼠,并与Lyz2-Cre转基因小鼠杂交,将后代自交获得髓系特异性NFIB cKO小鼠(NFIBfl/flLyz2-Cre小鼠)。经琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型后,选取C57BL/6N品系的NFIB cKO小鼠4只为实验组,非cKO小鼠4只为对照组。两组小鼠均使用2.5%葡聚糖硫酸钠盐以相同条件诱导,构建慢性结肠炎模型,从临床表现和组织病理学方面评估结肠炎严重程度。结果经分析发现NFIB在髓系细胞来源的粒细胞、单核细胞中均有表达,且在中性粒细胞中高表达。成功地利用CRISPR/Cas9技术和Cre-loxP系统构建了髓系特异性NFIB cKO小鼠。葡聚糖硫酸钠盐诱导的肠炎模型NFIB cKO小鼠在短时间内出现腹泻、肉眼血便、活动减少、体重减轻等情况。肠道大体观察显示NFIB cKO小鼠结肠较非cKO小鼠缩短[(8.23±0.35)cm vs(10.30±0.36)cm,P<0.01]。肠H-E染色显示NFIB cKO小鼠肠黏膜腺结构改变和结缔组织增生伴广泛炎症细胞浸润,NFIB cKO小鼠的组织学评分高于非cKO小鼠[(4.25±0.50)分vs(0.50±0.58)分,P<0.01]。肠免疫组织化学染色结果显示,CD11b阳性细胞在NFIB cKO小鼠较非cKO小鼠中募集更多。结论本实验成功构建了髓系特异性NFIB cKO小鼠,并发现髓系细胞中的NFIB能够减轻免疫细胞(粒细胞或/和单核细胞)浸润,抑制肠道炎症。 展开更多
关键词 条件性基因敲除 核因子IB 肠道炎症 髓系细胞 动物模型
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转录因子CREA敲除对黑曲霉形态和分泌β-葡萄糖苷酶的影响
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作者 程慧娟 王昕 +4 位作者 石小涛 马东旭 龚大春 胡骏鹏 谢智文 《生物技术通报》 北大核心 2025年第6期344-354,共11页
【目的】在黑曲霉中敲除转录因子CREA,探究其对菌丝发育和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)表达的调控作用,为开发高产BGL的细胞工厂提供有效的调控改造靶点。【方法】以黑曲霉菌株An-1为研究对象,构建敲除cre A基因的操作质粒和供体... 【目的】在黑曲霉中敲除转录因子CREA,探究其对菌丝发育和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)表达的调控作用,为开发高产BGL的细胞工厂提供有效的调控改造靶点。【方法】以黑曲霉菌株An-1为研究对象,构建敲除cre A基因的操作质粒和供体片段。经原生质体转化、抗性筛选和菌丝PCR验证,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,获得敲除菌株Δcre A。通过平板培养和摇瓶发酵,分别考察转录因子CREA对菌体形态和产BGL的影响,并在不同浓度葡萄糖下,探究碳阻遏效应对BGL生物合成的影响。【结果】在黑曲霉菌株An-1中对cre A基因进行了精准敲除,获得缺失突变菌株Δcre A。与野生型菌株相比,Δcre A菌株的菌落形态呈现车轮状褶皱,在七叶苷显色平板上表现出较强的β-葡萄糖苷酶分泌能力。以纤维二糖和p-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物,Δcre A菌株的BGL活性分别为野生型菌株的1.5倍和1.8倍。荧光定量PCR显示,cre A的敲除使bgl A基因的表达量提升了8.4倍。在添加不同浓度葡萄糖的发酵过程中,Δcre A菌株的酶活水平始终高于野生型,表现出脱碳阻遏效应。【结论】CREA转录因子调控黑曲霉的菌丝发育和BGL表达,其敲除减轻了碳阻遏效应,提高了黑曲霉产BGL的能力,为调控改造黑曲霉以优化BGL的生产性能提供了理论支持。 展开更多
关键词 黑曲霉 Β-葡萄糖苷酶 转录因子 CRISPR-Cas9 基因敲除 碳阻遏效应
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Th17细胞特异性敲除Stat3对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响
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作者 周亦凝 叶之韵 +3 位作者 陈慧文 谢欣宜 周薇 宋忠臣 《上海交通大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第7期838-845,共8页
目的·观察Th17细胞特异性敲除Stat3基因对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响。方法·通过Cre/LoxP系统繁育Th17细胞特异性敲除Stat3基因小鼠(Stat3^(fl/fl);Il17a-CreERT2,即Stat3^(△Il17a))及野生型小鼠(Stat3^(fl/fl),WT),腹... 目的·观察Th17细胞特异性敲除Stat3基因对牙周炎小鼠焦虑抑郁样行为的影响。方法·通过Cre/LoxP系统繁育Th17细胞特异性敲除Stat3基因小鼠(Stat3^(fl/fl);Il17a-CreERT2,即Stat3^(△Il17a))及野生型小鼠(Stat3^(fl/fl),WT),腹腔注射他莫昔芬诱导基因敲除,通过磁珠分选法提取小鼠CD4+T细胞并诱导其Th17细胞分化,采用反转录聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法验证基因敲除效率。实验分为4组,分别为野生型-对照组(WT-C)、基因敲除-对照组(Stat3^(△Il17a)-C)、野生型-牙周炎组(WT-P)和基因敲除-牙周炎组(Stat3^(△Il17a)-P),其中WT-P组和Stat3^(△Il17a)-P组采用龈沟注射牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,P.gingivalis-LPS)建立小鼠实验性牙周炎模型。4周后通过旷场实验、高架零迷宫实验和强迫游泳实验观察小鼠焦虑抑郁样行为;显微计算机断层成像观察小鼠牙槽骨吸收情况;苏木精-伊红染色观察海马神经元损伤情况,并采用酶联免疫吸附法检测小鼠脑组织中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达情况。结果·Stat3^(△Il17a)小鼠Th17细胞Stat3基因与蛋白表达均较WT小鼠显著下降(均P<0.05)。WT-P组和Stat3^(△Il17a)-P组成功建立小鼠实验性牙周炎模型,且Stat3^(△Il17a)-P组小鼠牙槽骨破坏程度较WT-P组轻。WT-P组小鼠与WT-C组小鼠比较,在旷场实验中进入中心区时间减少,在高架零迷宫实验中进入开放区时间减少,在强迫游泳实验中不动时间增加(均P<0.05),同时伴海马神经元损伤及BDNF表达水平显著下降(P<0.05)。Stat3^(△Il17a)-P组小鼠中异常行为学表现及海马神经元损伤程度,与WT-P组比较均有所减轻(均P<0.05),且Stat3^(△Il17a)-P组海马组织BDNF表达水平较WT-P组显著增加(P<0.05)。结论·牙周炎可导致小鼠产生焦虑抑郁样行为及神经元损伤,而Th17细胞特异性敲除Stat3基因可以显著减轻小鼠焦虑抑郁样行为和神经元病理改变;Stat3介导的Th17细胞免疫反应可能在牙周炎与焦虑、抑郁症状的关系中发挥重要的作用。 展开更多
关键词 牙周炎 焦虑抑郁样行为 Th17细胞 STAT3基因 条件性基因敲除 神经元损伤
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伪结核棒状杆菌lpxtg270敲除株的构建及其生物学特性与对小鼠的致病性评价
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作者 牛禄婷 吕红 +6 位作者 龙良辉 张艺千 徐成伟 周新智 王小华 王芝英 周作勇 《微生物学报》 北大核心 2025年第10期4550-4564,共15页
【目的】构建伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)宣汉株(XH02)LPXTG基序蛋白编码基因敲除菌株(XH02Δlpxtg270),探究lpxtg270在XH02生长、生物被膜形成及感染致病过程中的作用。【方法】采用CRISPR/Cas9技术构建XH0... 【目的】构建伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)宣汉株(XH02)LPXTG基序蛋白编码基因敲除菌株(XH02Δlpxtg270),探究lpxtg270在XH02生长、生物被膜形成及感染致病过程中的作用。【方法】采用CRISPR/Cas9技术构建XH02Δlpxtg270,比较该敲除菌株与野生菌株XH02在生物学特性、对J774A.1巨噬细胞的侵袭能力、体内感染小鼠致病力等方面的差异。【结果】与XH02相比,XH02Δlpxtg270的菌落形态、生长曲线、黏附J774A.1巨噬细胞的能力及胞内增殖能力均无明显变化,但XH02Δlpxtg270的生物被膜形成能力、对J774A.1的侵袭能力、感染引发J774A.1释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及分泌IL-1β的能力显著降低,XH02Δlpxtg270体内感染小鼠的致病力及在肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和脑中的载菌水平显著下降,引起小鼠上述脏器的病理变化较轻。【结论】本研究证实LPXTG270与Cp形成生物被膜、感染侵袭巨噬细胞的能力相关,在Cp感染小鼠致病过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 伪结核棒状杆菌 LPXTG基序蛋白基因lpxtg270 基因敲除 生物学特性 致病性
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TRIF敲除NA与BHK-21细胞系的构建及对狂犬病病毒增殖效率的影响
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作者 黄伟涛 李家琪 +3 位作者 彭瑶 殷相平 郭霄峰 罗均 《华南农业大学学报》 北大核心 2025年第5期627-636,共10页
【目的】通过CRISPR/Cas9技术构建β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptorinducing interferon β,TRIF)基因敲除小鼠NA细胞系与仓鼠BHK-21细胞系,评估狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)在敲除细胞系中的增殖能力,探究T... 【目的】通过CRISPR/Cas9技术构建β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptorinducing interferon β,TRIF)基因敲除小鼠NA细胞系与仓鼠BHK-21细胞系,评估狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)在敲除细胞系中的增殖能力,探究TRIF在RABV感染过程中的功能。【方法】首先,设计单向导RNA(Single guide RNA,sgRNA),构建用于TRIF基因敲除的重组质粒pSpCas9-NA-TRIF-KO和pSpCas9-BHK-21-TRIF-KO,将重组质粒转染野生型NA与BHK-21细胞,通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞,并使用有限稀释法获得单细胞亚克隆。随后,对筛选的细胞扩大培养,并通过PCR扩增、测序以及Western blot鉴定,最终筛选TRIF敲除NA与BHK-21细胞系。最后,将RABV标准攻击毒株CVS-11与疫苗毒株BNSP-SAD分别接种TRIF敲除细胞系与野生型细胞系,通过Western blot检测病毒N蛋白的表达水平,并利用TCID50检测病毒滴度,以评估RABV在不同细胞系中的增殖能力。【结果】成功构建了用于TRIF基因敲除的重组质粒pSpCas9-NA-TRIF-KO与pSpCas9-BHK-21-TRIF-KO,并筛选鉴定出TRIF基因敲除NA细胞系与BHK-21细胞系。与野生型细胞系相比,2种TRIF敲除细胞系接种RABV CVS-11与BNSP-SAD后,N蛋白的表达量均在感染24 h后明显升高,病毒滴度同样均在感染24 h后显著上升。【结论】相较于野生型细胞系,RABV在TRIF基因敲除细胞系中的增殖能力更优,TRIF可能具有抑制病毒复制的能力。研究结果为深入研究TRIF功能提供了有力支持,也为RABV的培养与研究提供了新的细胞模型。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 β干扰素TIR结构域衔接蛋白基因 基因敲除 狂犬病病毒
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变栖克雷伯氏菌DX120E中RpoN和NtrC的作用机制
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作者 黄颖 孙安妮 +4 位作者 盘杨飞 闫佳维 王雨仪 李杨瑞 邢永秀 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第2期130-138,147,共10页
【目的】探讨转录因子RpoN和NtrC对变栖克雷伯氏菌菌株DX120E氮代谢和生物学特性的影响,为该菌株在生物固氮领域的广泛应用奠定基础。【方法】在DX120EΔrpoN突变株基础上,利用同源重组技术构建DX120EΔrpoNΔntr C双突变株,并对其进行... 【目的】探讨转录因子RpoN和NtrC对变栖克雷伯氏菌菌株DX120E氮代谢和生物学特性的影响,为该菌株在生物固氮领域的广泛应用奠定基础。【方法】在DX120EΔrpoN突变株基础上,利用同源重组技术构建DX120EΔrpoNΔntr C双突变株,并对其进行鉴定。对DX120E野生型菌株、ΔrpoN突变株和ΔrpoNΔntrC双突变株的生长特性、运动能力、胞外多糖产量、生物膜形成及氨基酸代谢能力等进行比较分析。【结果】成功构建了DX120EΔrpoNΔntrC双突变株。与DX120E野生型菌株相比,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株在以蛋白胨和尿素为氮源的培养基上生长无明显差异,但在以硝酸钾为唯一氮源的培养基中无法正常生长,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株的硝酸盐利用能力、群集能力、胞外多糖产量和生物膜形成能力均有所减弱;DX120EΔrpoN突变株不能利用组氨酸,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株可以利用组氨酸,但不能利用脯氨酸;DX120EΔrpoN突变株和DX120EΔrpoNΔntrC双突变株在生长特性、泳动和群集、生物膜形成及胁迫耐受能力等方面无明显差异。【结论】RpoN和NtrC影响菌株DX120E的硝酸盐利用能力、群集能力、胞外多糖产量及生物膜形成能力,RpoN对DX120E的生物学特性调控占主导地位,RpoN和NtrC共同参与调控细菌对氨基酸的摄取及利用。 展开更多
关键词 变栖克雷伯氏菌 RPON NTRC 基因敲除
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干扰素-γ基因敲除小鼠饲养繁殖方法的优化
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作者 柳慧敏 何茜 +5 位作者 贾瑞莲 李娜 许瑞 冯耀宇 肖立华 郭亚琼 《中国实验动物学报》 北大核心 2025年第4期489-500,共12页
目的繁育获得干扰素-γ基因敲除纯合子(IFN-γ^(-/-))小鼠,并改善繁育策略,建立稳定的干扰素-γ基因敲除纯合子(IFN-γ^(-/-))小鼠繁育体系,为相关研究提供理想的动物模型。方法首先以C57BL/6J为背景的IFN-γ基因敲除杂合子(IFN-γ+/-)... 目的繁育获得干扰素-γ基因敲除纯合子(IFN-γ^(-/-))小鼠,并改善繁育策略,建立稳定的干扰素-γ基因敲除纯合子(IFN-γ^(-/-))小鼠繁育体系,为相关研究提供理想的动物模型。方法首先以C57BL/6J为背景的IFN-γ基因敲除杂合子(IFN-γ+/-)小鼠作为亲本进行繁育。之后,基于获得的子代小鼠,采用3种配种方式进行繁育:(1)雌性杂合子与雄性杂合子;(2)雄性纯合子与雌性杂合子;(3)雌性纯合子与雄性纯合子。并比较子代中IFN-γ^(-/-)小鼠的数量和存活情况,筛选最优繁育策略。在最优繁育策略下,评估雌鼠配种周龄和饲料种类对IFN-γ^(-/-)小鼠繁殖性能的影响,共统计60只IFN-γ^(-/-)雌鼠的前3胎窝产仔数、离乳存活数和离乳存活率,同时记录和分析了孕鼠营养补充、放置遮蔽物等环境优化措施对繁育效果的影响。结果在通过添加蛋黄以及瓜子充分保障孕鼠营养的条件下,雌性和雄性IFN-γ^(-/-)小鼠配种,单胎新生IFN-γ^(-/-)小鼠存活数为5~8只,繁育获得的IFN-γ^(-/-)小鼠的效率优于其他配种模式。此外,饲料种类和配种周龄对雌鼠繁殖性能影响显著,7~9周龄的雌性与雄性IFN-γ^(-/-)小鼠合笼配种并且饲喂繁殖饲料时,雌鼠的窝产仔数(6.9±1.7)、离乳存活数(6.5%±2.0%)和离乳存活率(93.2%±17.8%)均高于其他繁育条件。另外,通过放置遮蔽物预防种鼠打架有助于提高繁殖效果。结论采用优化的IFN-γ^(-/-)小鼠配种策略,结合高蛋白饲料饲喂、营养补充及规范化配种周龄管理,可显著提高IFN-γ^(-/-)小鼠的繁育效率和稳定性,为相关研究提供可靠的动物模型支持。 展开更多
关键词 干扰素-Γ 基因敲除小鼠 饲养 繁殖
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嗜水气单胞菌非编码RNA的功能研究
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作者 王嘉璐 蔡彤璇 +4 位作者 陈甜梦 李娜 刘瑶瑶 赵宝华 刘东 《天津师范大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期13-21,共9页
为了探究原核生物嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)中非编码RNA(sRNA)的功能,以嗜水气单胞菌A.hydrophila ATCC 7966菌株为实验材料,采用转录组测序技术进行转录组学分析,预测得到非编码RNA,构建了sRNA基因缺失突变体(△sRNA),并对△... 为了探究原核生物嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)中非编码RNA(sRNA)的功能,以嗜水气单胞菌A.hydrophila ATCC 7966菌株为实验材料,采用转录组测序技术进行转录组学分析,预测得到非编码RNA,构建了sRNA基因缺失突变体(△sRNA),并对△sRNA的生理特性和致病性进行测定.结果显示:△sRNA菌株与野生型菌株的生长状况、运动能力和溶血现象基本一致,且在高渗环境下2种菌株受到的抑制程度相同;同野生型菌株相比,△sRNA菌株的生物被膜形成能力与蛋白酶活性均显著降低(P<0.01),且△sRNA菌株对青霉素和红霉素的敏感度增强;sRNA基因的缺失导致A.hydrophila的致病性降低. 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 转录组测序 非编码RNA 基因敲除 致病性
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条件性胰岛β细胞HLF基因敲除小鼠构建与鉴定
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作者 侯梦龙 齐心语 +4 位作者 吴建凤 廖启超 马杰 周磊 李一星 《安徽医科大学学报》 北大核心 2025年第8期1432-1439,共8页
目的为了探究肝白血病因子(HLF)在糖尿病中的作用机制,构建条件性胰岛β细胞HLF基因敲除小鼠动物模型。方法在细胞水平上,通过CCK-8试验验证HLF抑制或过表达对MIN6细胞增殖的影响。通过RT-qPCR和Western blot,分别在mRNA水平和蛋白水平... 目的为了探究肝白血病因子(HLF)在糖尿病中的作用机制,构建条件性胰岛β细胞HLF基因敲除小鼠动物模型。方法在细胞水平上,通过CCK-8试验验证HLF抑制或过表达对MIN6细胞增殖的影响。通过RT-qPCR和Western blot,分别在mRNA水平和蛋白水平检测HLF抑制或过表达效果。将HLF flox/flox转基因小鼠与Pdx1-Cre+/-小鼠(C57BL/6J)杂交繁育,获得子代小鼠。利用PCR方法鉴定小鼠基因型,通过RT-qPCR技术和Western blot检测HLF基因在胰岛β细胞敲除小鼠(HLF flox/flox Cre+/-)和对照小鼠(HLF flox/flox)中的mRNA水平和蛋白水平表达差异,验证敲除效果。同时取2组小鼠的胰岛组织制作石蜡切片并进行苏木精-伊红(HE)染色分析。结果HLF基因抑制或过表达对MIN6细胞增殖无显著影响。在MIN6细胞中抑制HLF基因,其mRNA表达水平较对照组下降了74%,蛋白表达水平较对照组下降了60%;过表达HLF基因后,其mRNA表达水平为对照组的2.13倍,蛋白表达水平为对照组的1.8倍。敲除小鼠的HLF基因mRNA表达水平较对照组下降了89%,蛋白表达水平较对照组下降了65%。HE染色结果显示:敲除小鼠胰岛组织内细胞形态与对照小鼠无明显差异。抑制HLF使MIN6细胞中糖原含量提高约20%。结论成功构建HLF基因敲除小鼠,为研究HLF在糖尿病发病机制中的作用提供了动物模型。 展开更多
关键词 肝白血病因子 条件性胰岛β细胞 RT-QPCR Western blot 基因敲除 C57BL/6J小鼠
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GTKO猪的生产及猪-恒河猴肾脏异种移植
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作者 王艳 常悦 +15 位作者 杨畅 魏太云 霍晓颖 陈博威 王娇祥 赵恒 郭建雄 赵红芳 张雄 朱飞艳 成文敏 赵红业 徐凯祥 Muhammad Ameen Jamal 王振迪 魏红江 《器官移植》 北大核心 2025年第4期526-537,共12页
目的探讨α-1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)滇南小型猪的构建及猪到恒河猴的肾脏异种移植,评估GTKO猪的有效性。方法利用CRISPR/Cas9基因修饰系统和体细胞克隆技术构建GTKO滇南小型猪,通过聚合酶链反应、Sanger测序、免疫荧光... 目的探讨α-1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)滇南小型猪的构建及猪到恒河猴的肾脏异种移植,评估GTKO猪的有效性。方法利用CRISPR/Cas9基因修饰系统和体细胞克隆技术构建GTKO滇南小型猪,通过聚合酶链反应、Sanger测序、免疫荧光染色等验证GTKO猪的表型。流式细胞术检测抗原抗体(IgM)结合与补体依赖细胞毒性,并进行GTKO猪到恒河猴的肾脏异种移植,监测受体猴体液免疫、细胞免疫、凝血及生理指标,利用超声检查、苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色等分析移植肾功能和病理学改变。结果靶向滇南小型猪GGTA1基因第4外显子设计单向导RNA(sgRNA),将pGL3-GGTA1-sgRNA1-GFP载体转染到滇南小型猪胎儿成纤维细胞中,经嘌呤霉素筛选后,获得的C59#和C89#两个细胞克隆点均鉴定为GGTA1基因敲除克隆点,经扩大培养形成细胞系后用作供体细胞进行体细胞克隆,并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中,获得13头胎儿猪,其中F04和F11胎儿的GGTA1基因发生双等位基因突变,且F04核型正常,利用此GTKO胎儿猪进行重克隆,并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中,共获得7头存活仔猪,其均不表达α-Gal抗原表位。20#恒河猴血清IgM与GTKO猪PBMC结合数量减少,且GTKO猪PBMC在补体依赖细胞毒性实验中的存活率高于野生型猪。获取GTKO猪肾并进行灌注直至完全变白,切除受体猴左肾后进行猪肾异位移植,血管吻合完成后开放血流,猪肾迅速变为粉红色,未发生超急性排斥反应(HAR),6 min后输尿管出现尿液,表明肾移植术成功,再切除受体右肾。移植术后7 d移植肾血流供应良好,受体猴血清肌酐水平稳定,血清钾和胱抑素C水平得到有效控制,但在移植术后10 d均升高。移植术后7 d受体猴体内白细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞水平均升高,血小板计数和纤维蛋白原水平均降低,而活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和凝血酶原时间均较为稳定,之后呈上升趋势。受体猴存活10 d,尸检发现移植肾充血、肿胀和坏死,肾组织中少量IgG沉积,大量IgM、补体C3c和C4d沉积,CD68^(+)巨噬细胞浸润。结论GTKO滇南小型猪肾脏可在恒河猴体内维持一定时间的正常肾功能,并有效克服HAR,证实GTKO猪用于异种移植有效。 展开更多
关键词 GGTA1基因敲除猪 恒河猴 肾脏异种移植 基因修饰 超急性排斥反应 免疫抑制 外周血单个核细胞 体细胞核移植
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