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Error-prone PCR获得EPSP酶突变基因提高水稻的草甘膦抗性 被引量：10
1
作者 苏军 陈建民 +2 位作者 田大刚 朱祯 王锋 《分子植物育种》 CAS CSCD 2008年第5期830-836,共7页
将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进... 将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进行分子鉴定。对其中的3个株系进行农艺性状考察,并各选1个株系作为父本与其他优良恢复系进行杂交,进一步考察epsp和epsp102基因在不同遗传背景下的抗性和农艺性状表现。Southern结果显示:epsp的整合拷贝数为2～3拷贝,epsp102拷贝数为1～2拷贝。萌发种子、三叶期及分蘖期对草甘膦抗性检测显示:转基因萌发种子对草甘膦的抗性提高15倍;三叶期对草甘膦的抗性提高3～4倍。分蘖期剂量效应检测结果显示:非转基因对照在施0.1倍以上的致死剂量农达时,植株显著失水,而转基因株系水分生理正常。两地两季的农艺性状考察显示:与对照相比转基因株系的穗数明显增多,转基因株系ep-3和ep102-20结实率和单株重与对照没有显著差异;以ep-3和ep102-20作父本,与4个恢复系杂交的F2代对草甘膦的抗性没有降低,两个组合的结实率显著增加,SK/ep-3组合结实率显著下降,其余组合的结实率与对照持平。 展开更多
关键词 水稻 error-prone pcr EPSP酶突变基因 草甘膦
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Error-prone PCR致哈茨木霉几丁质酶突变的条件优化 被引量：2
2
作者 王傲雪 李微 +1 位作者 陈秀玲 李景富 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期134-138,共5页
运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,... 运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,使用5.0 mmol·L-1Mg2+,0.5 mmol·L-1Mn2+,0.04 mmol·L-1dATP和dGTP,1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP进行扩增后,随机挑选10个克隆测序,累积13 370个碱基,检测到57个突变,平均突变率为0.4%。为产生优良突变株、酶分子定向进化奠定基础。 展开更多
关键词 Error—prone pcr 哈茨木霉几丁质酶 Chit42 突变
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基于多重PCR的SNP基因分型及其在辣椒种质遗传多样性及关联分析中的应用
3
作者 黄月琴 陈学军 +5 位作者 方荣 周坤华 雷刚 李歌歌 方钰 袁欣捷 《植物遗传资源学报》 北大核心 2026年第1期132-151,I0047-I0054,共28页
利用简化基因组测序数据,开发了一套基于多重PCR的SNP基因分型panel,包含170个核心SNP标记。利用该SNP panel及30个表型性状对202份辣椒种质进行分析,解析其遗传多样性,发掘辣椒优良表型性状的关联位点。结果表明,170个核心SNP标记分布... 利用简化基因组测序数据,开发了一套基于多重PCR的SNP基因分型panel,包含170个核心SNP标记。利用该SNP panel及30个表型性状对202份辣椒种质进行分析,解析其遗传多样性,发掘辣椒优良表型性状的关联位点。结果表明,170个核心SNP标记分布于12条染色体上,香农指数平均为0.616,多态性信息含量平均为0.334,基因多样性平均值0.428,说明供试材料遗传多样性较好。基于SNP标记的聚类分析、群体结构分析和主成分分析结果较为一致,均将供试材料划分为5个类群,各类群与地理来源和果实形态有一定相关性。30个表型性状变异系数在7.00%~87.88%之间、平均为34.85%,ShannonWiener多样性指数在0.03~2.07之间、平均为1.19,其中单果重的变异系数最大,商品果纵径的Shannon-Wiener多样性指数最大,花冠颜色变异系数和Shannon-Wiener多样性指数均最小;表型性状间大部分存在显著或极显著相关性。进一步对表型性状、SNP标记进行关联分析,结果表明,GLM和MLM两种方法共检测到53个SNP关联位点,与12个表型性状显著关联;GLM和MLM分别可以解释4.83%~48.41%和10.86%~19.19%的表型变异,其中位于4号染色体的980-003标记对花冠颜色的表型变异解释率最高;53个关联位点里有4个位点被两种方法同时检测到。本研究所开发的SNP基因分型panel是一种通量高、准确性好且成本低的基因型鉴定方法,可应用于辣椒遗传结构分析、分子标记辅助育种、品种鉴定等研究。此外,本研究还构建了202份辣椒种质表型性状和基因型数据库,有效地建立了表型与基因型的对应关系,为辣椒优异基因发掘、种质创新和品种遗传改良提供理论指导和材料基础。 展开更多
关键词 辣椒 SNP基因分型 多重pcr 遗传多样性 关联分析
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猪肠道病毒和猪捷申病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立
4
作者 莫玲 于新友 +5 位作者 吕素芳 毕艳丽 张颖 李天芝 Ashenafi Kiros Wubshet 王文秀 《动物医学进展》 北大核心 2026年第2期49-53,共5页
为建立同时检测猪肠道病毒(PEV)和猪捷申病毒(PTV)的荧光RT-PCR方法,根据NCBI中PEV VP1(NCBI AF363453)和PTV VP1(NCBI GQ293092)基因序列,分别设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和扩增程序,建立了一种无需提取核酸即可同时检测PEV... 为建立同时检测猪肠道病毒(PEV)和猪捷申病毒(PTV)的荧光RT-PCR方法,根据NCBI中PEV VP1(NCBI AF363453)和PTV VP1(NCBI GQ293092)基因序列,分别设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和扩增程序,建立了一种无需提取核酸即可同时检测PEV和PTV的双重荧光RT-PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评估,并对临床样品进行检测。结果表明,20μL体系中各引物和探针最适加入量为:PEV-F 0.8μL、PEV-R 1.3μL、PEV-P 0.6μL、PTV-F 1.2μL、PTV-R 1.4μL和PTV-P 0.7μL,优化后的扩增程序为:90℃3 min;60℃反转录5 min;95℃5 s,52℃退火延伸20 s(此处收集荧光),共计40个循环。该对猪常见病原均无扩增,对PEV和PTV检测敏感性分别为5.13 TCID 50/100μL和3.47 TCID 50/100μL,对135份临床样品检测结果与传统核酸提取法结果一致。成功建立了PEV和PTV的免提取核酸双重荧光RT-PCR方法,特异性好,敏感性高,可用于临床两种疑似病例的快速检测。 展开更多
关键词 猪肠道病毒 猪捷申病毒 免提取核酸 荧光pcr
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黄芪根腐病菌锐顶镰刀菌的实时荧光定量PCR快速检测方法
5
作者 祖未希 赵丽梅 +2 位作者 赵雪姣 王雪 高芬 《河南农业科学》 北大核心 2026年第3期107-117,共11页
锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)是黄芪根腐病的重要病原菌之一。为实现锐顶镰刀菌的快速检测和准确定量,建立了一种实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并对其在黄芪植株和土壤样本检测中的实用性进行验证。结果表明,基于锐顶镰刀菌EF-1... 锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)是黄芪根腐病的重要病原菌之一。为实现锐顶镰刀菌的快速检测和准确定量,建立了一种实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并对其在黄芪植株和土壤样本检测中的实用性进行验证。结果表明,基于锐顶镰刀菌EF-1α序列设计的引物Fae F4/Fae R4特异性强,所建方法对黄芪和土壤中锐顶镰刀菌的检测灵敏度分别为DNA质量浓度2.56×10^(-3)ng/μL和分生孢子1×10^(2)个/g,标准曲线的相关系数分别为0.9997和0.9838,扩增效率分别为1.07和0.87。重复性评价显示方法可靠、稳定。利用该方法检测发现,黄芪样本接种锐顶镰刀菌1 h后即可检测到病菌存在,且侵染量随时间逐渐上升;田间疑似根腐发病样本的锐顶镰刀菌阳性检出率为100%;田间发病和未发病土壤样本中,病菌阳性检出率也为100%,且相同种植年限的发病土带菌量显著高于未发病土。因此,所建qPCR检测方法可用于黄芪植株和土壤中锐顶镰刀菌的检测,为黄芪根腐病的精准监测和及时防控提供可靠的技术支撑。 展开更多
关键词 黄芪 根腐病 锐顶镰刀菌 实时荧光定量pcr 检测
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细胞种属鉴别多重PCR法的优化及验证
6
作者 吴雪伶 张琪梦 +5 位作者 纳涛 魏山山 范珊珊 宗伟英 孟淑芳 杨志行 《中国生物制品学杂志》 2026年第2期180-188,共9页
目的对原有细胞种属鉴别多重PCR法进行再优化以及再验证,使其可适用于不同检测机构及实验室的检测。方法对猪、中国仓鼠、非洲绿猴和大鼠的引物序列及核酸提取方式、引物配比、参比细胞混合基因组DNA的配比、PCR扩增程序及DNA模板用量... 目的对原有细胞种属鉴别多重PCR法进行再优化以及再验证,使其可适用于不同检测机构及实验室的检测。方法对猪、中国仓鼠、非洲绿猴和大鼠的引物序列及核酸提取方式、引物配比、参比细胞混合基因组DNA的配比、PCR扩增程序及DNA模板用量进行优化,对优化后的方法进行灵敏度、交叉污染检测限度及不同实验室间的复核验证。结果优化后的方法可成功用于10个种属的细胞鉴别检测,方法灵敏度可达50~5000个细胞,交叉污染的检测水平可达1∶100~1∶10000,4家不同实验室均能利用该方法成功对细胞进行检测。结论优化后的细胞种属鉴别多重PCR法具有较好的专属性及检测细胞交叉污染的能力,可用于不同实验室的细胞种属鉴别检测,耐用性好,将为生产及检定用细胞的质量控制提供有效的技术手段。 展开更多
关键词 细胞种属 鉴别 多重pcr法 线粒体
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草莓根腐病病原足赤壳菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
7
作者 张家齐 董丽红 +3 位作者 付一帆 王培培 郭庆港 马平 《园艺学报》 北大核心 2026年第3期857-866,共10页
足赤壳菌(Dactylonectria spp.)是引起草莓根腐病的重要土传病原真菌之一。为实现该病原菌的快速、准确检测,基于足赤壳菌保守n-ethylammeline chlorohydrolase基因序列,设计特异性引物Da6-F/Da6-R及TaqMan探针Da6-P,建立了足赤壳菌Taq... 足赤壳菌(Dactylonectria spp.)是引起草莓根腐病的重要土传病原真菌之一。为实现该病原菌的快速、准确检测,基于足赤壳菌保守n-ethylammeline chlorohydrolase基因序列,设计特异性引物Da6-F/Da6-R及TaqMan探针Da6-P,建立了足赤壳菌TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。该检测方法特异性强、灵敏度高,能特异性区分足赤壳菌与其他常见草莓土传病原真菌及健康草莓组织或根围土壤;对质粒DNA、病原菌基因组DNA和土壤中孢子的检测灵敏度分别为10 copies·μL^(-1)、0.5 pg·μL^(-1)和10^(3)孢子·g^(-1)。人工拌土下,土壤发病阈值为9.17×10^(3)copies·g^(-1)(发病率30%)。通过检测29份自然发病样本,根围土壤qPCR检测和组织平板分离结果一致性达极显著水平(Cohen’s Kappa值0.592,P=0.0002)。 展开更多
关键词 草莓 根腐病 足赤壳菌 实时荧光定量pcr
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dPCR方法动态监测T790M突变在EGFR阳性非小细胞肺癌耐药治疗中的指导作用
8
作者 姚铠涛 曾小芸 +3 位作者 连逸恺 林建雄 王双玲 魏丹娜 《分子诊断与治疗杂志》 2026年第1期131-134,共4页
目的本研究旨在探讨使用数字PCR(dPCR)方法动态监测血浆EGFR T790M突变的可行性,并评估基于血浆T790M突变检测的早期干预是否可作为EGFR突变非小细胞肺癌患者EGFR-TKI转换治疗的最佳时机。方法初筛2021年7月至2023年12月在汕头大学医学... 目的本研究旨在探讨使用数字PCR(dPCR)方法动态监测血浆EGFR T790M突变的可行性,并评估基于血浆T790M突变检测的早期干预是否可作为EGFR突变非小细胞肺癌患者EGFR-TKI转换治疗的最佳时机。方法初筛2021年7月至2023年12月在汕头大学医学院第二附属医院75例接受埃克替尼治疗的EGFR阳性Ⅳ期NSCLC患者,T790M突变率为53.3%,最终纳入40例患者。试验组(n=18)在血浆检测到T790M突变后更换第三代EGFR-TKI治疗,对照组(n=22)在影像学进展及T790M突变后更换EGFR-TKI治疗。比较两组的临床疗效、无进展生存期(PFS)及不良反应。结果试验组的客观缓解率(ORR)为72.2%,对照组为68.2%,两组差异无统计学意义(P>0.05)。试验组的疾病控制率(DCR)为94.4%,对照组为81.9%,差异无统计学意义(P>0.05)。试验组的中位PFS显著长于对照组,差异有统计学意义(14.8个月vs 10.3个月,P=0.024)。两组的不良反应均为1~2级,皮疹、腹泻及肝功能异常的发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论使用dPCR动态监测血浆EGFR T790M突变,可较影像学更早识别一代EGFR-TKI耐药,从而及时转换三代EGFR-TKI治疗,延缓疾病进展,是一种经济且临床可行的策略。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 EGFR T790M 数字pcr 三代酪氨酸激酶抑制剂
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猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立
9
作者 孙健 赵柏林 《山东畜牧兽医》 2026年第1期8-12,共5页
猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)作为一种重要的人畜共患病毒,其在全球范围内传播和蔓延引起了广泛关注,尤其是在近年来的疫情中,及时有效的检测方法显得尤为重要。为建立一种快速诊断MPXV的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F... 猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)作为一种重要的人畜共患病毒,其在全球范围内传播和蔓延引起了广泛关注,尤其是在近年来的疫情中,及时有效的检测方法显得尤为重要。为建立一种快速诊断MPXV的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F3L(462 bp,GenBank登录号AF380138.1)保守区域,设计了1对特异性的引物和1条探针,建立了猴痘病毒荧光定量PCR检测方法。结果显示,本方法仅能有效检测MPXV,与牛结节皮肤病病毒、非洲猪瘟病毒VP72片段质粒、圆环病毒Ⅱ型标准品均无交叉反应;对重组质粒标准品的最低检测限为5.1 copies/μL;批内与批间的重复试验变异系数均小于6%。结果表明,本试验方法具有较强的敏感性、特异性和稳定性,可以用于猴痘病毒的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猴痘病毒 荧光定量 pcr 检测方法
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机场道面承载能力ACR-PCR评价方法及其改进方向
10
作者 袁捷 李杰 +2 位作者 马鲁宽 凌建明 姜昌山 《同济大学学报(自然科学版)》 北大核心 2026年第2期255-263,共9页
道面承载能力评价是保障飞机安全运行的重要工作之一。在回顾飞机分类号-道面分类号(aircraft classification number-pavement classification number,ACN-PCN)评价方法基本原理并总结其局限性的基础上,阐述了飞机分类等级-道面分类等... 道面承载能力评价是保障飞机安全运行的重要工作之一。在回顾飞机分类号-道面分类号(aircraft classification number-pavement classification number,ACN-PCN)评价方法基本原理并总结其局限性的基础上,阐述了飞机分类等级-道面分类等级(aircraft classification rating-pavement classification rating,ACR-PCR)评价方法的优化内容;明确了ACR和PCR的计算方法,并通过算例对比分析了2种方法,同时提出了改进方向。结果表明,ACR-PCR评价方法优化了标准道面结构、当量单轮胎压等参数,更新了道面结构破坏模式的控制准则及力学响应计算方法,实现了与现行设计方法的统一;ACR值不能简单地用10倍的ACN值表示,并且ACR-PCR评价方法对刚性道面承载能力提出了更高要求;建议在优化标准结构的基础上,提出针对无机结合料稳定类基层道面的ACR计算方法以及刚性道面上加铺层复合道面承载能力ACR-PCR评价方法。 展开更多
关键词 机场工程 机场道面 承载能力 ACR-pcr评价方法
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猪肉中常见的人畜共患细菌和寄生虫多重荧光PCR检测方法的建立与初步应用
11
作者 韩亚星 赵格 +7 位作者 赵建梅 宋时萍 高玉斌 刘娜 黄秀梅 王琳 王君玮 黄娟 《动物医学进展》 北大核心 2026年第4期54-63,共10页
为了建立快速、敏感、可同时检测猪肉中多种病原的多重荧光定量PCR,本研究针对猪肉中13种重要病原的特异基因保守序列,分别设计了引物及不同荧光基团标记的TaqMan探针,构建了含有目的基因的重组质粒,并用其进行反应体系优化,以及敏感性... 为了建立快速、敏感、可同时检测猪肉中多种病原的多重荧光定量PCR,本研究针对猪肉中13种重要病原的特异基因保守序列,分别设计了引物及不同荧光基团标记的TaqMan探针,构建了含有目的基因的重组质粒,并用其进行反应体系优化,以及敏感性、特异性和重复性验证。结果显示,建立的3组三重与1组四重荧光定量PCR法能够在同一反应条件下2 h内完成对13种病原的特异性检测,反应体系中的多条引物探针间不发生交叉反应;最低检出限:致病性大肠埃希氏菌、沙门氏菌均为1拷贝/μL,单增李斯特菌为10拷贝/μL,结肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌均为10~2拷贝/μL,住肉孢子虫、猪丹毒杆菌、弓形虫、囊尾蚴、蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、小肠结肠炎耶尔森菌均为10~3拷贝/μL;重复性试验变异系数均在2.33%以下。多重荧光PCR和普通PCR法对30份猪肉样品的病原总体检出率分别为83%(25/30)和56.7%(17/30),二者总体符合率达到66.7%~100%。猪肉中常见13种病原的三重/四重荧光定量PCR检测方法的成功建立,为猪肉病原学检测和流行病学调查提供技术支撑,有助于保障猪肉食品安全。 展开更多
关键词 猪肉 病原菌 寄生虫 病原检测 多重荧光定量pcr
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基于直接PCR的转基因种子纯度快速检测方法
12
作者 翟杉杉 李俊 +4 位作者 肖芳 李允静 武玉花 高鸿飞 吴刚 《中国油料作物学报》 北大核心 2026年第1期168-181,共14页
种子纯度检测对于保证种子质量,提高作物产量具有重要意义。建立快速、准确、低成本的转基因种子纯度检测技术将为推进生物育种产业化发展提供有力支撑。本研究基于直接PCR技术提出了一种转基因种子纯度快速检测方案,包括:(1)利用自主... 种子纯度检测对于保证种子质量,提高作物产量具有重要意义。建立快速、准确、低成本的转基因种子纯度检测技术将为推进生物育种产业化发展提供有力支撑。本研究基于直接PCR技术提出了一种转基因种子纯度快速检测方案,包括:(1)利用自主研发的快速提取试剂,在常温下实现单粒种子研磨、提取同步进行,2分钟内一步式实现核酸提取,提取液无需纯化、直接作为模板进行实时荧光PCR扩增;(2)配制PCR反应体系;(3)样品分板;(4)高通量检测;(5)种子纯度计算。利用本方法对3种转基因大豆中黄6106、DBN9004、SHZD3201种子样品进行纯度检测,15份样品从制样到结果鉴定一个工作日内全部完成。该方法简化了现有纯度检测技术的操作步骤,显著缩短了分析时间,为转基因种子纯度检测提供了一种可靠的单粒快速检测新方法。 展开更多
关键词 转基因种子 纯度检测 DNA快速提取 直接pcr
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山茶花花香生物合成相关基因的实时荧光定量PCR内参基因的筛选及验证
13
作者 陈艺荃 樊荣辉 +3 位作者 林兵 陈燕 吴建设 钟淮钦 《园艺学报》 北大核心 2026年第2期598-612,共15页
为研究山茶花花香生物合成相关基因的表达模式,筛选在山茶花中稳定表达的内参基因。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测10个候选内参基因(α-TUB、CYP、PP2A、ACTIN1、ACTIN2、GAPDH、UBQ、AQP、UBC和HIS)在不同的组织、开花阶段、... 为研究山茶花花香生物合成相关基因的表达模式,筛选在山茶花中稳定表达的内参基因。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测10个候选内参基因(α-TUB、CYP、PP2A、ACTIN1、ACTIN2、GAPDH、UBQ、AQP、UBC和HIS)在不同的组织、开花阶段、品种和混合样品中的表达水平,geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder 4种算法综合评估和鉴定内参基因的表达稳定性。结果显示,10个候选内参基因的引物特异性好,均具有作为内参基因的性能;分析山茶花不同开花阶段基因表达时可选用PP2A和UBC,分析不同组织和不同香型品种基因表达时最理想的内参基因为PP2A和ACTIN1,其中PP2A在山茶花不同的组织、开花阶段、香型品种和混合样品中均能稳定表达。通过qRT-PCR扩增了花香相关的9个靶基因,验证PP2A是山茶花花香相关基因表达研究的最佳内参基因,而以传统管家基因GAPDH为内参时,山茶花芳樟醇/橙花叔醇合酶基因CaLIS/NES1和苯乙醛还原酶基因CaPAR的表达模式出现较大偏差。 展开更多
关键词 山茶花 花香 内参基因 实时荧光定量pcr 表达分析 PP2A
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槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因筛选及验证
14
作者 蒋萌 白晓宁 +4 位作者 王文波 赵亚洲 胡增辉 苏淑钗 冷平生 《中南林业科技大学学报》 北大核心 2026年第1期211-220,234,共11页
[目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、T... [目的]筛选在不同器官及盐胁迫下表达稳定的槲树内参基因,验证所选内参基因在qRT-PCR中的适用性和稳定性,为精准评价槲树目标基因表达量提供理论依据。[方法]从槲树盐胁迫转录组中筛选出10个高表达传统管家基因作为候选内参基因(TUBA、TUBA、GAPDH、Actin、EIF2B5、UBE2W、ADCK、EEF1B、UBE2J1和EIF5A),采用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件和ΔCt程序对候选基因在槲树中的表达稳定性进行分析。以槲树6个器官(根、茎、叶、叶芽、花序、种子)及盐胁迫下4个不同处理时期(CK、3 h、24 h、96 h)的叶片为样品,通过qRT-PCR技术,结合候选内参基因,验证过氧化氢酶基因QdCAT2在槲树不同器官及盐胁迫下的表达模式以及候选内参基因的表达稳定性。[结果]10个候选内参基因中,EIF5A和UBE2W的表达稳定性最高,综合排名位居前列,EIF2B5为最不稳定内参基因。QdCAT2基因在槲树叶片中表达量最高,且随着盐胁迫时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势,在处理3 h后达到高峰,使用EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合作为内参基因得到的相对表达结果基本一致,表明EIF5A和UBE2W为槲树各器官及盐胁迫最适合的内参基因。[结论]成功筛选出了2个稳定内参基因,并验证了EIF5A、UBE2W及EIF5A+UBE2W组合均适合作为槲树不同器官及盐胁迫下qRT-PCR的内参基因,为槲树不同器官及盐胁迫下基因表达分析提供了参考,并为后续槲树分子生物学研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 槲树 实时荧光定量pcr 内参基因筛选 盐胁迫 表达分析
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牛星状病毒和诺如病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
15
作者 姜玲玲 罗文菊 +4 位作者 艾蓉 周景瑞 张琴 冯明祥 余波 《贵州农业科学》 2026年第3期116-123,共8页
【目的】建立一种同时快速检测牛星状病毒(BAstV)和诺如病毒(BNoV)的方法,为及时制定相关疫情防控方案提供技术指导。【方法】根据BAstV中ORF2基因和BNoV中RdRp基因的保守区域分别设计特异性引物,建立能同时检测BAstV和BNoV的双重TaqMa... 【目的】建立一种同时快速检测牛星状病毒(BAstV)和诺如病毒(BNoV)的方法,为及时制定相关疫情防控方案提供技术指导。【方法】根据BAstV中ORF2基因和BNoV中RdRp基因的保守区域分别设计特异性引物,建立能同时检测BAstV和BNoV的双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,对该方法的敏感性、特异性、重复性及临床样品进行试验检测。【结果】建立的双重TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法可扩增BAstV和BNoV核酸,未能扩增牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛环曲病毒(BToV)、牛冠状病毒(BCoV)核酸,特异性强;对BAstV和BNoV的最低检测量分别为1.19 pg/μL和0.82 pg/μL,敏感性高;重复性试验检测中,变异系数均小于1%,重复性好;临床检测213份样品,BAstV和BNoV的阳性检出率分别为23.94%和7.98%,明显高于单一SYBR Green染料法。【结论】牛星状病毒和诺如病毒双重荧光PCR方法敏感性高、特异性强,用便携式荧光定量PCR仪可在60 min内完成检测,适用于养殖场BAstV和BNoV感染的快速检测。 展开更多
关键词 牛 牛星状病毒 牛诺如病毒 犊牛腹泻 双重感染 实时荧光定量RT-pcr
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16SrⅡ组槟榔黄化植原体巢式PCR检测方法的建立
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作者 林兆威 唐庆华 +2 位作者 于少帅 龙仕达 宋薇薇 《热带作物学报》 北大核心 2026年第3期694-701,共8页
在中国,引起槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,AYLD)的植原体主要有16SrⅠ组、16SrⅡ组及16SrXXXⅡ组3个种群,但目前的检测技术主要针对16SrⅠ组或3个种群的共同检测,缺乏对16SrⅡ组植原体的特异性识别手段。为了对16SrⅡ组... 在中国,引起槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,AYLD)的植原体主要有16SrⅠ组、16SrⅡ组及16SrXXXⅡ组3个种群,但目前的检测技术主要针对16SrⅠ组或3个种群的共同检测,缺乏对16SrⅡ组植原体的特异性识别手段。为了对16SrⅡ组槟榔黄化植原体进行特异性检测,本研究基于16SrⅡ组植原体核糖体蛋白(rp)基因序列,设计并筛选特异性巢式PCR引物,并对该方法的特性及其应用效果进行评估。结果显示,在准确性方面,该方法能准确区分出阳性和阴性样品;在敏感性比较中,该方法敏感性高于16S rRNA和tuf基因的通用巢式PCR检测;在特异性评估中,16SrⅠ组和16SrXXXⅡ组植原体、供试的槟榔病原及内生菌均对本方法未造成干扰;在应用中,从海南文昌采集的22份槟榔样品检测出4份阳性样品,并且可检测出属于16SrⅡ组的银胶菊丛枝植原体、皱子鸟足菜丛枝植原体及花生丛枝植原体,表现出较好的适用性。综上,本研究建立的基于rp基因的巢式PCR方法对16SrⅡ组槟榔黄化植原体检测具有较好的特异性,可为16SrⅡ组槟榔黄化植原体的田间诊断、病情监测提供技术参考。 展开更多
关键词 槟榔 槟榔黄化病 植原体检测 巢式pcr
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基于边缘无浆体msp4基因的PCR检测方法的建立及应用
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作者 廖培淇 朱子奇 +4 位作者 苏中华 甘富斌 李俊强 陈远才 张龙现 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期77-82,共6页
为建立特异、敏感、快速的边缘无浆体PCR检测方法,以其msp4基因的保守区为靶标设计一对特异性引物。优化PCR反应条件后,进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,所建立的方法能够特异性检测边缘无浆体核酸,而与其他... 为建立特异、敏感、快速的边缘无浆体PCR检测方法,以其msp4基因的保守区为靶标设计一对特异性引物。优化PCR反应条件后,进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床样品检测。结果显示,所建立的方法能够特异性检测边缘无浆体核酸,而与其他动物常见血液原虫无交叉反应;该方法的检测下限为380 fg/μL,拷贝数为126拷贝/反应;批内、批间试验结果表明,该方法具有良好的重复性和稳定性;对120份牦牛血液临床样本检测结果表明,该方法检测边缘无浆体阳性率为54.1%(65/120),高于文献报道方法检测结果37.5%(45/120),表明该方法具有良好的敏感性和准确性。成功建立了一种敏感、特异、快速的边缘无浆体PCR检测方法,为我国牛无浆体病的流行病学调查和诊断防控提供了技术支撑。 展开更多
关键词 边缘无浆体 msp4基因 pcr 牛无浆体病
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暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交F_(1)代的荧光PCR鉴定技术的建立
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作者 赵昕 车帅 +4 位作者 王焕 孙侦龙 尤颖哲 柳淑芳 庄志猛 《渔业科学进展》 北大核心 2026年第1期37-47,共11页
暗纹东方鲀(Takifugu obscurus♀)×红鳍东方鲀(T.rubripes♂)的杂交F_(1)代具备双亲诸多优良性状,市场前景较好。但杂交F_(1)代的形态特征与其亲本难以区分,为河鲀种质资源保护和开发利用带来了困扰,迫切需要开发有效的分子鉴定方... 暗纹东方鲀(Takifugu obscurus♀)×红鳍东方鲀(T.rubripes♂)的杂交F_(1)代具备双亲诸多优良性状,市场前景较好。但杂交F_(1)代的形态特征与其亲本难以区分,为河鲀种质资源保护和开发利用带来了困扰,迫切需要开发有效的分子鉴定方法对杂交F_(1)代及其亲本进行精准判别。为实现杂交F_(1)代及其亲本的快速准确鉴定,本研究根据核基因SH3PX3多态性SNP位点,设计荧光PCR扩增引物及探针,优化了荧光PCR参数,建立了暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交F_(1)代的荧光PCR鉴定方法,并对该方法进行了验证。结果显示:杂交F_(1)代的COI序列与母本暗纹东方鲀的序列相似度为100%,在NJ进化树中聚为一支,无法实现杂交F_(1)代和母本的区分;SH3PX3基因荧光PCR体系最佳退火温度为48℃;荧光PCR扩增后,暗纹东方鲀仅FAM通道有Ct值,ΔCt值大于20,红鳍东方鲀FAM信号通道比HEX通道的Ct值高2~5,杂交F_(1)代的FAM通道与HEX通道的Ct值接近,二者之差小于2;基于上述方法对17份暗纹东方鲀、21份红鳍东方鲀和53份杂交F_(1)代样品进行验证,鉴定准确率为100%。本研究建立的荧光PCR鉴定方法不仅具有结果准确、易判读等优点,还避免了测序等繁琐流程,可实现高通量检测,显著提高了检测效率,为河鲀种质资源鉴定与保护、杂交育种和遗传多样性研究提供了技术支持。 展开更多
关键词 暗纹东方鲀 红鳍东方鲀 杂交F_(1)代 SH3PX3基因 荧光pcr 物种鉴定
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猪圆环病毒2型微滴数字PCR检测方法的建立及临床应用
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作者 刘武函 唐小明 +8 位作者 彭志 张坤 谢怡灵 范仲鑫 王卫国 尚玲 张梦凡 杨青 胡巧云 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2026年第1期120-125,共6页
为建立一种特异性强、敏感性高、重复性好的猪圆环病毒2型(PCV-2)微滴数字PCR检测方法,试验基于PCV-2 ORF1保守区域设计引物和探针,通过优化引物浓度、探针浓度和退火温度及特异性、敏感性和重复性试验建立微滴数字PCR方法,并采用该方法... 为建立一种特异性强、敏感性高、重复性好的猪圆环病毒2型(PCV-2)微滴数字PCR检测方法,试验基于PCV-2 ORF1保守区域设计引物和探针,通过优化引物浓度、探针浓度和退火温度及特异性、敏感性和重复性试验建立微滴数字PCR方法,并采用该方法对90份临床样本进行检测。结果表明:建立的PCV-2微滴数字PCR检测方法的最佳引物和探针浓度分别为18μmol/L和9μmol/L,退火温度为61℃;能特异性检出PCV-2,与多种常见猪病原[猪圆环病毒3型(PCV-3)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)]无交叉反应;最低检测限为3.48 copies/μL;重复性试验中扩增后的拷贝数组内与组间变异系数范围分别在0.91%~6.13%和1.44%~8.53%之间,均小于10%。90份临床样本中,建立的微滴数字PCR方法检出PCV-2阳性样本43份,检出率为47.78%,经统计微滴数字PCR方法检出的阳性样本包含了实时荧光定量PCR方法检出的所有阳性样本,与实时荧光定量PCR方法的符合率为88.89%。说明本研究建立的PCV-2微滴数字PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于临床样本(特别是低病毒载量样本)的检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 微滴数字pcr 病毒检测 检测方法 特异性试验 敏感性试验 重复性试验
原文传递
奶牛乳腺炎致病菌三重qPCR检测方法的建立
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作者 康新华 赵雯 牛琼 《中国牛业科学》 2026年第1期29-37,共9页
为建立奶牛乳腺炎主要致病菌的快速检测方法,选择大肠埃希氏菌(Escherichia coli)phoA基因、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)mdh基因、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)femA基因以及内标基因ACtB的保守区序列设计合成特异性... 为建立奶牛乳腺炎主要致病菌的快速检测方法,选择大肠埃希氏菌(Escherichia coli)phoA基因、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)mdh基因、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)femA基因以及内标基因ACtB的保守区序列设计合成特异性引物探针,建立了奶牛乳腺炎大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的三重荧光PCR检测方法。该方法可特异性检出3种常见的奶牛乳腺炎致病菌,与无乳链球菌、停乳链球菌、牛支原体、沙门氏菌等常见病原无交叉反应,特异性强;对phoA、mdh和femA的最低检出限分别为16.9、16.7和20.4拷贝/μL,且组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。用该方法对90份奶牛乳腺炎生乳样本进行检测,检测结果与单一荧光PCR方法一致。表明所建立的奶牛乳腺炎大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点,适用于奶牛乳腺炎的临床诊断检测。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 大肠埃希氏菌 肺炎克雷伯菌 金黄色葡萄球菌 三重荧光qpcr
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