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Error-prone PCR获得EPSP酶突变基因提高水稻的草甘膦抗性 被引量：10
1
作者 苏军 陈建民 +2 位作者 田大刚 朱祯 王锋 《分子植物育种》 CAS CSCD 2008年第5期830-836,共7页
将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进... 将通过Error-prone PCR方法获得的表达水稻EPSP酶突变基因epsp102和未经修饰的水稻epsp基因分别导入籼稻恢复系明恢86,获得转化克隆84个和109个。对T1、T2代转基因水稻三叶期和分蘖期喷施草甘膦,各选出4个对草甘膦高抗性的T3代材料,进行分子鉴定。对其中的3个株系进行农艺性状考察,并各选1个株系作为父本与其他优良恢复系进行杂交,进一步考察epsp和epsp102基因在不同遗传背景下的抗性和农艺性状表现。Southern结果显示:epsp的整合拷贝数为2～3拷贝,epsp102拷贝数为1～2拷贝。萌发种子、三叶期及分蘖期对草甘膦抗性检测显示:转基因萌发种子对草甘膦的抗性提高15倍;三叶期对草甘膦的抗性提高3～4倍。分蘖期剂量效应检测结果显示:非转基因对照在施0.1倍以上的致死剂量农达时,植株显著失水,而转基因株系水分生理正常。两地两季的农艺性状考察显示:与对照相比转基因株系的穗数明显增多,转基因株系ep-3和ep102-20结实率和单株重与对照没有显著差异;以ep-3和ep102-20作父本,与4个恢复系杂交的F2代对草甘膦的抗性没有降低,两个组合的结实率显著增加,SK/ep-3组合结实率显著下降,其余组合的结实率与对照持平。 展开更多
关键词 水稻 error-prone pcr EPSP酶突变基因 草甘膦
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Error-prone PCR致哈茨木霉几丁质酶突变的条件优化 被引量：2
2
作者 王傲雪 李微 +1 位作者 陈秀玲 李景富 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期134-138,共5页
运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,... 运用Error-prone PCR对哈茨木霉几丁质酶基因(Chit42)进行人工突变。在常规PCR基础上,通过提高体系中Mg2+浓度,适当加入一定浓度Mn2+,调节四种dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dGTP)浓度,得到产生明显突变效果的试验条件。在Error-prone PCR中,使用5.0 mmol·L-1Mg2+,0.5 mmol·L-1Mn2+,0.04 mmol·L-1dATP和dGTP,1.5 mmol·L-1dTTP和dCTP进行扩增后,随机挑选10个克隆测序,累积13 370个碱基,检测到57个突变,平均突变率为0.4%。为产生优良突变株、酶分子定向进化奠定基础。 展开更多
关键词 error—prone pcr 哈茨木霉几丁质酶 Chit42 突变
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易错PCR技术改造黑曲霉β-甘露聚糖酶的耐温性
3
作者 陈晓飞 李珊珊 +3 位作者 周伏忠 刘德海 王佰涛 刁文涛 《中国饲料》 北大核心 2025年第17期53-60,共8页
为改造黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶基因Man26A,获得耐温性重组β-甘露聚糖酶,本试验通过易错PCR技术(在PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2)),将目的基因Man26A克隆至载体pGAPZαA上,构建重组质粒pGAPZαA-Man26A,将重组质粒电转化至毕赤酵... 为改造黑曲霉来源的β-甘露聚糖酶基因Man26A,获得耐温性重组β-甘露聚糖酶,本试验通过易错PCR技术(在PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2)),将目的基因Man26A克隆至载体pGAPZαA上,构建重组质粒pGAPZαA-Man26A,将重组质粒电转化至毕赤酵母GS115中,在含有100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选耐温性突变体,并测定重组酶的酶学性质。本试验筛选出2株产耐温性β-甘露聚糖酶的重组突变体3-228和4-59,两重组酶的最适pH和温度分别为5.0和45℃,均与野生型酶相同,但与野生型相比,两重组酶的工作温度范围更加宽泛,且温度稳定性显著提高;金属离子Fe^(2+)、Mg^(2+)、Mn^(2+)、K+、Ca^(2+)、Co^(2+)对β-甘露聚糖酶活力有不同程度的激活作用,SDS、EDTA、Cd^(2+)、Cu^(2+)、Ni^(2+)、Ag^(2+)、Fe^(3+)、Pb^(2+)等对酶活力有不同的抑制作用。2个耐温性重组β-甘露聚糖酶均具有工作温度范围广、耐温性强等特点,提高了其在饲料工业上的应用潜力,证明了易错PCR技术是提高酶温度稳定性的有效方法。 展开更多
关键词 Β-甘露聚糖酶 易错pcr 耐温性 酶学性质
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基于易错PCR技术的短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶基因BpL的定向进化 被引量：21
4
作者 黄瑛 蔡勇 +1 位作者 杨江科 闫云君 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期445-451,共7页
利用易错PCR技术对短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)YZ02脂肪酶基因BpL进行两轮定向进化研究,分别获得最佳突变株BpL1-7和BpL2-1369,其脂肪酶活力比出发酶分别提高了2倍和6倍。序列分析表明,突变体BpL2-1369有4个碱基发生了突变:T61C/C14... 利用易错PCR技术对短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)YZ02脂肪酶基因BpL进行两轮定向进化研究,分别获得最佳突变株BpL1-7和BpL2-1369,其脂肪酶活力比出发酶分别提高了2倍和6倍。序列分析表明,突变体BpL2-1369有4个碱基发生了突变:T61C/C147T/A334G/T371A,其中有3个碱基突变导致了氨基酸的改变。通过SWISS-MODEL数据库模拟脂肪酶的结构显示,3个突变氨基酸分别位于第1个α螺旋的第3个氨基酸、第4和第5个β折叠之间的转角以及第5个β折叠的第1个氨基酸位置。将野生型脂肪酶基因BpL和进化后的基因BpL2-1369的高效表达产物经Ni-Agarose柱和Sephadex-G75纯化后,酶学性质测定表明:突变脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍,Km值由8.24mmol/L降低至7.17mmol/L;在pH>8.0时的稳定性较野生型脂肪酶有所提高。 展开更多
关键词 短小芽胞杆菌 脂肪酶 定向进化 易错pcr
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基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化 被引量：11
5
作者 张赛 邢克克 +3 位作者 胡亚冬 谢春芳 刘大岭 姚冬生 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1100-1108,共9页
运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶(HRP)-隐性亮绿(RBG)快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突... 运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶(HRP)-隐性亮绿(RBG)快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突变酶A1476,pH 4.0和pH 7.5均表现稳定性的突变酶A2863,其酶活力比野生酶分别提高了6.5倍、21倍和12.6倍。经序列分析表明,发现突变酶A1773发生了Glu127Lys和Gln613Arg突变;突变酶A2863发生了Gly73Ser、Ile307Leu、Val596Ala、Gln613Arg突变;突变酶A1476发生了Ser46Pro、Lys221Gln、Ile307Leu和Asn471Ile突变。结果为进一步了解黄曲霉毒素解毒酶的结构与功能之间的关系提供了参考。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素解毒酶 稳定性 定向进化 易错pcr
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易错PCR研究进展及应用 被引量：10
6
作者 高义平 赵和 +2 位作者 吕孟雨 杨学举 王海波 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期607-612,共6页
易错PCR是目前最简单、有效的一种基因体外随机诱变技术,是农业、工业、生物制药等领域获得优异基因的重要手段。本文综述了易错PCR的基本原理、方法、发展历程,以及该技术的最新研究成果、成功应用领域,并提出了目前存在的问题和可能... 易错PCR是目前最简单、有效的一种基因体外随机诱变技术,是农业、工业、生物制药等领域获得优异基因的重要手段。本文综述了易错PCR的基本原理、方法、发展历程,以及该技术的最新研究成果、成功应用领域,并提出了目前存在的问题和可能解决途径。 展开更多
关键词 易错pcr 随机诱变 研究进展
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易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性 被引量：6
7
作者 唐自钟 刘姗 +6 位作者 韩学易 姚友旭 刘默洋 陈惠 晋海军 吴琦 单志 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期754-761,共8页
近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行... 近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明：F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变：D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。 展开更多
关键词 枯草芽胞杆菌 内切葡聚糖酶 易错pcr 酶学性质
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定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力 被引量：15
8
作者 王睿 喻晓蔚 +1 位作者 沙冲 徐岩 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1892-1899,共8页
运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4... 运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。 展开更多
关键词 定向进化 易错pcr 华根霉脂肪酶 脂肪酶活力
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基于易错PCR的假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶耐高温定向进化 被引量：7
9
作者 吕晓慧 胡亚冬 +2 位作者 胡凤娟 刘大岭 姚冬生 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1900-1906,共7页
本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的... 本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30min后最大酶活力为25U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍。序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个β折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角。 展开更多
关键词 定向进化 Β-甘露聚糖酶 易错pcr 热稳定性
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易错PCR定向进化大幅度提高极耐热β-葡聚糖酶的活性 被引量：5
10
作者 吴华伟 张展 +1 位作者 李相前 李迅 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期1-4,共4页
采用易错PCR方法对来自于极耐热海栖热袍菌的内切葡聚糖酶Cel1B进行定向进化。携带有Cel12B基因的重组质粒pET-20b-Cel12B在固定Mn2+浓度下,通过使用不同浓度的Mg2+优化易错PCR条件,产物构建成pET-20b-Mu-Cel12B重组子,并建立突变体文库... 采用易错PCR方法对来自于极耐热海栖热袍菌的内切葡聚糖酶Cel1B进行定向进化。携带有Cel12B基因的重组质粒pET-20b-Cel12B在固定Mn2+浓度下,通过使用不同浓度的Mg2+优化易错PCR条件,产物构建成pET-20b-Mu-Cel12B重组子,并建立突变体文库,重组子经改进的刚果红平板法筛选,通过透明圈的大小获得了酶活性大幅度提高的突变体3个,突变基因经诱导后的酶活力分别是在同样条件下诱导获得的亲本酶的2.1倍、3.2倍和3.7倍。 展开更多
关键词 内切β-葡聚糖酶 易错pcr筛选 酶活
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基于易错PCR定向进化扩展青霉Penicillium expansum FS1884碱性脂肪酶 被引量：3
11
作者 施碧红 陈明 +2 位作者 翟妙仙 严蕾 陈文静 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期64-68,共5页
为改善扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的活性及酶学性质,利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884脂肪酶基因PEL进行随机突变,在大肠杆菌JM109中构建突变文库。含突变脂肪酶基因的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板初筛和橄榄油... 为改善扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的活性及酶学性质,利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884脂肪酶基因PEL进行随机突变,在大肠杆菌JM109中构建突变文库。含突变脂肪酶基因的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板初筛和橄榄油检验板复筛,获得一株酶活性提高的脂肪酶突变体:PEL-ep25-GS。与野生型脂肪酶PEL-GS相比,在最适温度40℃、pH9.4时突变体的酶活力是野生型酶的1.3倍。测序结果表明:该突变体第253位氨基酸发生了突变,由赖氨酸变成蛋氨酸。 展开更多
关键词 易错pcr 脂肪酶 酶活
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Mn^(2+)驱动的不同长度DNA片段PCR随机突变研究 被引量：2
12
作者 廖红东 陆剑 +2 位作者 刘选明 王磊 朱咏华 《湖南大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第6期92-95,共4页
针对倾向错误的PCR技术中不同目的、不同长度基因的诱变种类一直缺乏准确参考的问题,以酵母spt15基因为研究对象,在标准的PCR反应体系中加入不同Mn2+摩尔浓度(0.125,0.250和0.500mmol.L-1)进行倾向错误的PCR,扩增spt15不同长度(分别约为... 针对倾向错误的PCR技术中不同目的、不同长度基因的诱变种类一直缺乏准确参考的问题,以酵母spt15基因为研究对象,在标准的PCR反应体系中加入不同Mn2+摩尔浓度(0.125,0.250和0.500mmol.L-1)进行倾向错误的PCR,扩增spt15不同长度(分别约为200,500和700bp)的DNA片段,研究其突变频率,突变碱基数目及突变类型,以分析不同种类的突变所需的最佳条件.研究结果表明:长片段DNA的PCR突变率对Mn2+摩尔浓度更敏感;模板的长度对DNA PCR突变碱基个数也有较为明显的影响,低Mn2+摩尔浓度有利于单突变;Mn2+驱动的突变有明显的倾向性,其中A→G和T→C的突变居多. 展开更多
关键词 突变 倾向错误pcr 锰离子 DNA片段
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基于易错PCR技术定向进化枯草芽孢杆菌β-葡聚糖酶 被引量：3
13
作者 邵敏 李长福 +1 位作者 葛正龙 周鹤峰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期141-145,共5页
利用易错PCR技术对来自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因(bgls)进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过易错PCR技术得到突变基因产物,将其重组于表达载体pET32a(+),构建β-葡聚糖酶基因的突... 利用易错PCR技术对来自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶基因(bgls)进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,通过易错PCR技术得到突变基因产物,将其重组于表达载体pET32a(+),构建β-葡聚糖酶基因的突变体文库,通过刚果红平板染色法进行高通量筛选,最终获得两株突变酶,其最适作用温度比野生酶都提高了15℃,最适pH与野生酶基本相同,野生酶酶活力为84.2 U/mL,突变酶酶活力分别为247.3 U/mL和125.1 U/mL,是野生酶酶活的2.9倍和1.5倍。试验获得了具有耐高温高酶活的β-葡聚糖酶,为β-葡聚糖酶的工业化应用奠定基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 Β-葡聚糖酶 易错pcr 定向进化
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基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化 被引量：2
14
作者 陈英 朱绮霞 +2 位作者 张搏 陈东 黄日波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期181-185,共5页
利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来... 利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来的40 mg/mL降低为12.5 mg/mL。对其三维结构进行分析,推测酶学性质的改变可能与处在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的I58A、和处在下部β卷曲折叠拐角处的S375G的突变有关。 展开更多
关键词 黏质沙雷氏菌 脂肪酶 易错pcr 定向进化
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通过原位易错PCR一步构建基因突变文库 被引量：3
15
作者 王未未 张永昌 +1 位作者 刘明杰 邵蔚蓝 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期719-724,共6页
主要介绍一种通过原位易错PCR构建随机突变文库的新技术。本实验室最近发表的一项国际专利中,利用来源于海栖热孢菌的极耐热性DNA连接酶,在传统PCR循环中加入一个连接步骤,即变性—退火—延伸—连接的四步循环法PCR,从而实现环状质粒的... 主要介绍一种通过原位易错PCR构建随机突变文库的新技术。本实验室最近发表的一项国际专利中,利用来源于海栖热孢菌的极耐热性DNA连接酶,在传统PCR循环中加入一个连接步骤,即变性—退火—延伸—连接的四步循环法PCR,从而实现环状质粒的PCR指数扩增(PPCP)。原位易错PCR中所用引物为一段线性双链DNA,它含有与模板质粒不同的筛选标记,产物转化宿主菌后,模板质粒在筛选平板上被直接剔除。筛选到的阳性突变子可用作模板直接进入突变文库的再次构建,通过筛选获得二级或多级累加的正突变。利用这种方法构建了一个木聚糖酶基因和一个纤维素酶基因的随机突变文库,并筛选出具有正向突变的蛋白,证明以PPCP为基础的原位易错PCR技术,为基因定向进化提供了一种快速有效的随机突变文库构建的新方法。 展开更多
关键词 定向进化 随机突变文库 原位易错pcr 环状质粒扩增(PPCP)
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易错PCR技术提高耐碱木聚糖酶基因xylBYG耐热性的研究 被引量：2
16
作者 张雯 石丽娜 +2 位作者 付宁 杨明明 龚月生 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第2期1-4,166,共5页
为了研究耐碱木聚糖酶基因xylBYG耐热性,试验采用易错PCR技术对耐碱木聚糖酶基因xylBYG进行定向进化,经过2轮易错PCR产生突变基因产物,重组于表达载体pET-32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21构建突变体文库。结果表明:经筛选获得了最佳突变菌... 为了研究耐碱木聚糖酶基因xylBYG耐热性,试验采用易错PCR技术对耐碱木聚糖酶基因xylBYG进行定向进化,经过2轮易错PCR产生突变基因产物,重组于表达载体pET-32a(+)中,并导入大肠杆菌BL21构建突变体文库。结果表明:经筛选获得了最佳突变菌株37D07,包含4个氨基酸替换,其最适作用温度比野生型提高了13℃,酶活约提高了17%,热稳定性也相应提高。 展开更多
关键词 木聚糖酶 易错pcr 最适作用温度 酶活 热稳定性
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易错PCR技术改造扩展青霉脂肪酶 被引量：1
17
作者 施碧红 李强 +3 位作者 陈明 吴伟斌 施巧琴 吴松刚 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期25-28,共4页
利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,对300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛,进一步摇瓶复筛后获得优良突变株ep3,所产突变脂肪酶(ep3-GS... 利用易错PCR技术,建立脂肪酶基因随机突变文库,将随机突变脂肪酶基因转化毕赤酵母GS115,初步筛选了4000株突变菌株,对300株较优突变株进行酶的活力、耐热性、耐酸性的摇管复筛,进一步摇瓶复筛后获得优良突变株ep3,所产突变脂肪酶(ep3-GS)的适宜pH为9.4,适宜作用温度为35℃,与野生重组脂肪酶(PEL-GS)一致,该温度下酶的比活为3440 U/mg,比野生型脂肪酶提高17%。 展开更多
关键词 易错pcr 改造 扩展青霉 脂肪酶
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错配PCR和DNA改组技术提高抗肝癌单链抗体亲和力 被引量：2
18
作者 卢筱华 杨冬华 +1 位作者 汤绍辉 周旻 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1203-1206,共4页
目的:采用错配PCR和DNA改组技术制备抗肝癌单链抗体。方法:联合采用错配PCR和DNA改组技术随机突变抗肝癌单链抗体A4-16重链和轻链可变区,构建抗肝癌噬菌体抗体次级突变库,利用噬菌体展示技术从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果:抗... 目的:采用错配PCR和DNA改组技术制备抗肝癌单链抗体。方法:联合采用错配PCR和DNA改组技术随机突变抗肝癌单链抗体A4-16重链和轻链可变区,构建抗肝癌噬菌体抗体次级突变库,利用噬菌体展示技术从中筛选出高亲和力单链抗体突变株。结果:抗肝癌噬菌体抗体次级突变库容为4·5×107,经过3轮富集筛选和ELISA鉴定获得2株突变株M25、M36,不仅保留原始克隆的特异性,而且相对亲和力指数分别为原始克隆的2倍和2·4倍。结论:错配PCR结合DNA改组技术是提高单链抗体亲和力的一种有效的手段。 展开更多
关键词 错配pcr DNA改组 肝肿瘤 抗体亲和力
暂未订购
优化易错PCR条件以提高毕赤酵母GAP启动子文库突变效率 被引量：2
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作者 秦秀林 钱江潮 储炬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期211-217,共7页
高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR(error-prone PCR,EP-PCR)条件,实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变,对EP-PCR反应条件进行了优化。考察了模板浓... 高效的随机突变策略对于构建含有丰富突变体的启动子文库至关重要。为了建立一个突变率适中并能获得较多有益突变子的易错PCR(error-prone PCR,EP-PCR)条件,实现毕赤酵母GAP启动子的高效突变,对EP-PCR反应条件进行了优化。考察了模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度对EP-PCR的产物得率和突变率的影响后,确定了适于GAP启动子突变的EP-PCR条件:模板浓度、反应循环数和Mg2+浓度分别为1 ng/μL、25和10 mmol/L。优化EP-PCR条件后,GAP启动子突变率为1.1%,连续进行3轮EP-PCR后突变率可达到4.0%。利用优化后EP-PCR对GAP启动子进行随机突变,筛选了250个突变子,获得5个启动子强度高于野生型GAP启动子的突变体,有益突变达到了2%,可用于构建GAP启动子文库。 展开更多
关键词 易错pcr 突变效率 随机突变 毕赤酵母 GAP启动子
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深海古菌超嗜热α-淀粉酶易错PCR致突变的条件研究 被引量：2
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作者 房耀维 王淑军 +5 位作者 刘姝 吕明生 李玉静 高爱伟 倪云霞 滕晓栋 《淮海工学院学报（自然科学版）》 CAS 2009年第2期86-89,共4页
采用易错PCR技术在深海古菌菌株Thermococcus siculiHJ21超嗜热α-淀粉酶基因中引入突变,研究了Mg2+浓度、Mn2+浓度、dCTP和dTTP浓度等条件对突变率的影响。结果表明,在Mg2+浓度为5.0 mmol/L,Mn2+浓度为0.4 mmol/L,dTTP和dCTP浓度为1.5 ... 采用易错PCR技术在深海古菌菌株Thermococcus siculiHJ21超嗜热α-淀粉酶基因中引入突变,研究了Mg2+浓度、Mn2+浓度、dCTP和dTTP浓度等条件对突变率的影响。结果表明,在Mg2+浓度为5.0 mmol/L,Mn2+浓度为0.4 mmol/L,dTTP和dCTP浓度为1.5 mmol/L的条件下,碱基突变率为3.2%。 展开更多
关键词 易错pcr 条件 突变率
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