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A群轮状病毒和塞内卡病毒双重RT-qPCR检测方法的建立及应用
1
作者 刘星 罗霆宇 +5 位作者 张玉 李凯丽 尹博曌 李昌文 夏长友 高彩霞 《实验动物科学》 2025年第3期30-37,共8页
目的 建立A群轮状病毒(PoRVA)和塞内卡病毒(SVA)双重RT-qPCR检测方法,并对其进行初步应用。方法 通过比对A群轮状病毒和塞内卡病毒毒株序列,选取PoRVA NSP3基因、SVA VP1基因保守区域分别设计引物和探针,建立PoRVA和SVA双重RT-qPCR检测... 目的 建立A群轮状病毒(PoRVA)和塞内卡病毒(SVA)双重RT-qPCR检测方法,并对其进行初步应用。方法 通过比对A群轮状病毒和塞内卡病毒毒株序列,选取PoRVA NSP3基因、SVA VP1基因保守区域分别设计引物和探针,建立PoRVA和SVA双重RT-qPCR检测方法。随后对方法的特异性和敏感性进行检测;取浓度为10~6~10^(3)copies/μL 10倍系列稀释的重组质粒标准品,每个浓度做3个平行,重复检测3次,计算组内和组间变异系数,评估方法的重复性和稳定性;用建立的双重RT-qPCR检测方法与《GB/T34756—2017猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法》和《SN/T 5486—2022塞内卡病毒病检疫技术规范》的检测方法进行比对,并检测15份猪粪便样品和35份猪肛拭子样品,评估该方法的实际应用性。结果 建立的双重RT-qPCR方法在10~9~10~1 copies/μL范围Ct值与质粒浓度呈线性关系,PoRVA标准曲线Slope为-3.085,r^(2)值为0.993,扩增效率为110.956%,SVA标准曲线Slope为-3.085,r^(2)值为0.993,扩增效率为110.935%,可检测到的PoRVA和SVA最低限均为10~1 copies/μL;且与其他7种实验猪常见病原不发生交叉反应;重复检测10~6~10^(3 )copies/μL质粒标准品,组内变异系数小于0.15%,组间变异系数小于1.50%。用建立的双重RT-qPCR方法与《GB/T34756—2017猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法》和《SN/T 5486—2022塞内卡病毒病检疫技术规范》方法检测15份猪粪便样品和35份猪肛拭子样品,结果显示,RT-qPCR检测出PoRVA阳性100%(50/50),SVA阳性66%(33/50),《GB/T34756—2017猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法》检测阳性率100%(50/50),《SN/T 5486—2022塞内卡病毒病检疫技术规范》检测阳性率24%(12/50),阳性符合率达到100%。结论 本研究建立的双重RT-qPCR检测方法可以有效地检测PoRVA和SVA,可为猪群的疫病检测和日常监测提供技术支撑。 展开更多
关键词 A群轮状病毒 塞内卡病毒 双重RT-qpcr检测方法建立及应用
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类NADC30与类NADC34 PRRSV双重qPCR检测方法的建立与应用 被引量：1
2
作者 马明洋 余文轩 +7 位作者 安川叶 张晶晶 杨紫烨 殷笑妍 杜叶 朱瑞冰 韩冬梅 刘冠慧 《中国动物检疫》 CAS 2024年第12期89-94,共6页
近年来,类NADC3O和类NADC34猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)给养猪业带来了严重经济损失。为实现类NADC30和类NADC34 PRRSV的同时检测,针对PRRSV经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株和类NADC34毒株ORF5基因的明显差异区域序列,设计引... 近年来,类NADC3O和类NADC34猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)给养猪业带来了严重经济损失。为实现类NADC30和类NADC34 PRRSV的同时检测,针对PRRSV经典毒株、高致病性毒株、类NADC30毒株和类NADC34毒株ORF5基因的明显差异区域序列,设计引物与探针,经优化引物和探针浓度及退火温度,建立了类NADC30和类NADC34 PRRSV双重qPCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,比较该方法与文献报道方法对临床样本检测结果的一致性。结果显示:本研究建立的双重qPCR方法仅对类NADC30和类NADC34 PRRSV核酸扩增呈阳性,而对其他常见猪病病原均无扩增,且类NADC30与类NADC34 PRRSV检测方法之间无交叉反应;对类NADC30和类NADC34 PRRSV核酸的最低检测限分别为1和10 copies/uL,组内及组间试验变异系数均小于2%;该方法与文献报道方法对类NADC30和类NADC34 PRRSV检测结果的符合率分别为89.5%和92.9%。结果表明,本研究建立的双重qPCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性佳,能够有效区分类NADC30和类NADC34 PRRSV,为猪繁殖与呼吸综合征诊断和流行病学调查提供了技术支撑。 展开更多
关键词 类NADC30 PRRSV 类NADC34 PRRSV 双重qpcr 建立及应用
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伪狂犬病病毒RT-qPCR检测方法的建立与应用
3
作者 李家奇 周汛 +1 位作者 汪涛 吴文明 《五邑大学学报（自然科学版）》 CAS 2024年第4期1-8,共8页
为建立伪狂犬病病毒(PRV)高灵敏度、超快速双重实时荧光定量PCR检测方法,根据PRV经典毒株gD和gE基因的相对保守序列设计了多组引物探针,经试验筛选出2组最优特异性引物探针,通过正交试验对反应体系中引物和探针的浓度进行优化,通过特异... 为建立伪狂犬病病毒(PRV)高灵敏度、超快速双重实时荧光定量PCR检测方法,根据PRV经典毒株gD和gE基因的相对保守序列设计了多组引物探针,经试验筛选出2组最优特异性引物探针,通过正交试验对反应体系中引物和探针的浓度进行优化,通过特异性、灵敏度和重复性试验评测所建立检测方法的性能.结果表明,建立的检测方法具有多重优点:高灵敏度,gD和gE基因最低检测灵敏度分别为1.06 copies/μL和1.68 copies/μL;超快速,检测时间可缩短至1 h内;特异性好,阴性对照组中常见猪患病毒均无交叉反应,PRV野毒株出现了双gD和gE基因扩增曲线,缺失gE基因的疫苗株仅出现gD基因扩增曲线;重复性强,3次重复性批内与批间试验的变异系数均低于3%.综上所述,本研究建立的双重RT-qPCR检测方法可用于PRV野毒株和疫苗株感染的快速诊断鉴别,为猪伪狂犬病(PR)的诊断及流行病学监测提供了一种快速准确的检测方法. 展开更多
关键词 双重RT-qpcr 猪伪狂犬病 伪狂犬病病毒 疫苗株 野毒株
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鉴别家兔多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏菌的双重TaqMan qPCR方法的建立 被引量：2
4
作者 程序 仇汝龙 +7 位作者 范志宇 胡波 陈萌萌 宋艳华 薛家宾 朱伟峰 钱莺娟 王芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期671-677,共7页
为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔... 为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR方法,并初步用于检测家兔肺脏及鼻拭子临床样本。结果显示,该方法建立的标准曲线在标准品浓度为2.35×106~2.35 copies/μL时有良好的线性关系;与绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌无交叉反应;最低检测限均为2.35 copies/μL;批内、批间重复性检验变异系数均小于2%。检测70份临床样本DNA结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为50.0%,支气管败血波氏菌阳性率为42.9%,混合感染率为21.4%,该方法与细菌分离培养和常规PCR符合率分别为80.0%、 92.0%。以上数据表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,无需病原菌的培养即可用于临床样品的快速检测,为兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、高效、准确的检测方法。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 支气管败血波氏菌 双重TaqMan qpcr
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小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：7
5
作者 袁向芬 吴绍强 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2012年第7期30-34,共5页
对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVⅣ系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明:建立的二重荧光RT-PCR方... 对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVⅣ系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明:建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道(通用型)和TAMRA信号通道(Ⅱ系疫苗毒特异型)的检测灵敏度分别可达101TCID50/mL和102TCID50/mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 鉴别 疫苗毒与感染毒 二重 荧光RT-PCR
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可同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的双重实时荧光RT-qPCR检测方法的建立及验证
6
作者 李晓波 冯育芳 +5 位作者 王淑菁 王莎莎 李威 秦骁 王吉 付瑞 《实验动物科学》 2025年第5期16-23,共8页
目的建立可同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的双重实时荧光RT-qPCR检测方法并对其进行方法学验证。方法通过比对NCBI公布的小鼠诺如病毒(MNV)及小鼠轮状病毒(MRV)基因组序列,分别选取MNV VP1基因及MRV NSP5基因保守序列设计引物探针,通... 目的建立可同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的双重实时荧光RT-qPCR检测方法并对其进行方法学验证。方法通过比对NCBI公布的小鼠诺如病毒(MNV)及小鼠轮状病毒(MRV)基因组序列,分别选取MNV VP1基因及MRV NSP5基因保守序列设计引物探针,通过优化引物及探针浓度,建立可在一次反应中同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的Taqman实时荧光RT-qPCR检测方法。使用MNV及MRV的RNA标准品验证双重及单重方法的定量范围及最低检测限;MNV及MRV RNA标准品各设10^(1)~10^(5) copies/μL等5个浓度,等体积混合形成浓度矩阵,单因素方差分析比较不同浓度的MNV及MRV之间是否会对定量结果产生干扰;对10^(1),10^(3),10^(5) copies/μL 3个浓度的RNA标准品进行批间及批内检测,验证方法的重复性;通过检测544份小鼠粪便样品验证方法实际应用性能,同时用普通RT-PCR法检测相同的90份小鼠粪便样品,卡方检验比较两种方法结果的差异。结果建立的双重RT-qPCR方法可在10^(1)~10^(8) copies/μL范围实现对MNV及MRV的有效定量,标准曲线各参数均在正常范围:R^(2)值均为0.999,斜率(MNV-3.332,MRV-3.250)、扩增效率(MNV 99.6%,MRV 103.1%)、单重法标准曲线与双重法相似,各参数值差别不大;最低检测限分别为:MNV单重及双重法均为3.125 copies/μL,MRV单重法为6.25 copies/μL,双重法为3.125 copies/μL;批内各浓度Ct值变异系数为0.63%~1.24%,批间变异系数为3.60%~5.57%;干扰实验表明低浓度标准品的检测(MNV10^(1)~10^(3) copies/μL,MRV 10^(2)及10^(3) copies/μL)易受到高浓度对应模板的干扰,导致所测定量值偏高;用所建立的双重RT-qPCR检测临床样品,结果MNV阳性率为1.8%(10/544),MRV未检出阳性样品。检测相同的90份小鼠粪便样品,双重实时荧光RT-qPCR检出10份MNV阳性样品,普通RT-PCR可检出8份;两种方法均可检出1份MRV阳性样品,经卡方检验两者结果无统计学差异。结论本研究所建立的双重实时荧光RT-qPCR方法可用于实验小鼠中MNV及MRV的快速高效的常规健康监测。 展开更多
关键词 小鼠诺如病毒 小鼠轮状病毒(乳鼠流行性腹泻病毒) 双重实时荧光定量反转录聚合酶链式反应
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