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人星状病毒和人札幌病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 林鹏 吴毓薇 +6 位作者 赵昕宇 蒋富凤 万强 薛亮 徐环 蔡芷荷 吴清平 《微生物学通报》 北大核心 2025年第4期1810-1829,共20页
【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加... 【背景】人星状病毒(human Astrovirus,HAstV)和人札幌病毒(human Sapovirus,HuSaV)是引起人类急性胃肠炎的重要病原体,尤其对婴幼儿、老年人和免疫力低下等人群造成严重的威胁。目前尚无疫苗和特异性手段防控病毒的感染与传播,因此加强检测对防控病毒的传播具有重要的意义。【目的】建立能同时检测HAstV和HuSaV的双重荧光定量RT-PCR方法,为HAstV和HuSaV的快速检测和流行病学调查提供技术支持。【方法】针对HAstV和HuSaV保守区域基因序列,设计特异性检测引物和探针并优化反应体系,建立HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法,并分析其特异性、敏感性和重复性。【结果】HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法针对HAstV和HuSaV最低检测线分别为15 copies/μL和2.1 copies/μL;与其他常见的食源性病毒、致病菌和乳酸菌无交叉反应;批内和批间重复性试验变异系数均小于3.5%。采用人工模拟不同浓度的病毒污染牡蛎样品,结果显示HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法能检测出所有受污染的牡蛎样品,与阳性对照组检测结果差异不显著(P>0.05);利用所建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法检测不同食品样品的HAstV和HuSaV,其阳性率分别为10.83%和0%。【结论】本研究建立的HAstV和HuSaV双重荧光定量RT-PCR检测方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,适用于食品样品中HAstV和HuSaV的快速检测及大规模流行病学调查。 展开更多
关键词 人星状病毒 人札幌病毒 双重荧光定量RT-pcr检测方法
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O型口蹄疫病毒和塞内卡病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:10
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作者 张展 陈信全 +2 位作者 冯国金 黄慧贤 利光辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期601-607,共7页
为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定... 为建立O型口蹄疫病毒(FMDV-O)和塞内卡病毒(SVV)快速鉴别检测方法,本实验根据FMDV-O VP2基因序列和SVV P3基因序列,采用Primer Express3.0软件分别设计引物与探针,并经各反应条件的优化初步建立了可同时鉴别检测FMDV-O和SVV的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测临床常见猪病毒,结果显示可同时检测出FMDV-O和SVV核酸,且与猪水泡性口炎病毒(VSV)、猪水疱病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)、A-1型口蹄疫病毒(FMDVA-1)核酸均无交叉反应,并可检测到FMDV-O PanAsia株、cathay株、Ind-2001株和Mya-98株等主要流行株,特异性强;该方法对含FMDV-O和SVV拼接质粒标准品的最低检测限为7.17×10^(2)拷贝/μL,敏感性高;利用该方法检测了同一时间和不同时间提取的3种不同浓度的质粒标准品,结果显示批内和批间重复性试验Ct值的变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验所建立的方法对30份临床样品进行检测,结果与各病毒单一荧光定量RT-PCR检测结果一致。本研究建立的FMDV-O和SVV双重荧光定量RT-PCR方法能够快速准确的鉴别检测FMDV-O和SVV,为口岸检疫的快速通关提供了技术手段。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 塞内卡病毒 双重RT-qpcr方法 P3基因 VP2基因
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Duplex PCR Detection of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola and Curtobacterium flaccumfaciens pv,flaccumfaciens in Soybean
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作者 Liu Yan Yang Wanfeng +3 位作者 Liu Xiang Shao Peize Chen Yunqing Zhao Wenjun 《Plant Diseases and Pests》 CAS 2016年第1期27-31,共5页
The paper aimed to establish a duplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola (Psp) and Curtobaeterium /accumfadens pv. Flaccumfaciens (Cff). Based on the argK gene of Psp ... The paper aimed to establish a duplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola (Psp) and Curtobaeterium /accumfadens pv. Flaccumfaciens (Cff). Based on the argK gene of Psp in GenBank, the primers PSPF1/PSPR2 were designed. The duplex PCR assay was dereloped using the combined primers PSPF1/PSPR2 and CflF1/CffR2, which were specific primers for Cff. The reaction conditions were optimized and specificity md sensitivity of the duplex PCR were tested. The expected DNA fragment was specifically amplified from the genomic DNA of Psp and Cff. Specificity was conirmed in the artificially inoculated soybean samples imparted. Thus, the duplex PCR developed in this study could be used for the simultaneous detection of Psp md Cff from imported soybean. 展开更多
关键词 Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola (Psp) Curtobacteriumflaccumfacierts pv. flaccumfaciens (Gff) duplex pcr Detection method
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PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用 被引量:6
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作者 徐引弟 王治方 +3 位作者 朱文豪 张青娴 焦海燕 郭成留 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2009年第9期184-186,共3页
参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增... 参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重RT—pcr 鉴别方法
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双重PCR法同步检测菜豆晕疫病菌和萎蔫病菌 被引量:4
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作者 杨万风 刘艳 +3 位作者 刘翔 邵沛泽 谌运清 赵文军 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第9期1612-1618,共7页
为建立同步检测菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌的双重PCR方法,根据Gen Bank上公布的菜豆晕疫病菌arg K基因特异性序列设计1对特异性引物PSPF1/PSPR2,将设计的引物与已发表的检测菜豆细菌性萎蔫病菌特异性引物Cff F1/CffR2结合,经过条件优... 为建立同步检测菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌的双重PCR方法,根据Gen Bank上公布的菜豆晕疫病菌arg K基因特异性序列设计1对特异性引物PSPF1/PSPR2,将设计的引物与已发表的检测菜豆细菌性萎蔫病菌特异性引物Cff F1/CffR2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。结果显示,采用双重PCR体系,能从菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌基因组DNA以及人工模拟带菌大豆种子样品中扩增到特异性条带,表明本研究所建立的双重PCR检测方法能同时检测出菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌,可用于口岸进口大豆中2种检疫性细菌的检测。 展开更多
关键词 菜豆晕疫病菌 菜豆细菌性萎蔫病菌 双重pcr 检测方法
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H10N8亚型禽流感病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:4
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作者 包红梅 田国彬 +2 位作者 曾显营 王秀荣 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1233-1238,共6页
为建立检测H10N8亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究选取H10N8亚型AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因中高度保守区域的核苷酸序列,设计引物和探针。通过反应条件优化,建立了针对H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方... 为建立检测H10N8亚型禽流感病毒(AIV)的双重荧光定量RT-PCR方法,本研究选取H10N8亚型AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因中高度保守区域的核苷酸序列,设计引物和探针。通过反应条件优化,建立了针对H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方法。该方法可特异性地检测出H10N8亚型AIV的HA和NA基因,与其它亚型AIV及其他常见禽呼吸道病原均无交叉反应;能够检测到AIV的最低检出量为10-1 EID50/0.1 mL,比常规RT-PCR方法敏感100倍;批内和批间重复性试验的变异系数(CV)均小于2%。SPF鸡感染试验样品检测结果显示,该双重荧光定量RT-PCR方法和病毒分离鉴定方法的符合率为94.44%,与常规RT-PCR方法的符合率为88.23%,而常规RT-PCR方法与病毒分离方法的符合率为83.33%,表明该方法与病毒分离方法的准确率更接近,可以用于临床检测。本实验结果表明H10N8亚型AIV的双重荧光定量RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便,为H10N8亚型AIV的检测及监测提供了有力的技术手段。 展开更多
关键词 禽流感 H10N8 双重荧光定量RT-pcr 检测方法
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口蹄疫病毒通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 谢彩华 班付国 +7 位作者 闫若潜 王东方 张煜 刘梅芬 赵雪丽 马震原 王华俊 王淑娟 《中国动物检疫》 CAS 2018年第12期70-74,共5页
为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用... 为建立一种快速、敏感、特异的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)分型鉴别诊断实时荧光RT-PCR(Fluorescence quantitative,FQ-PCR)检测方法,根据O、A、AsiaⅠ三种血清型FMDV保守基因序列,设计能够检测到FMDV的特异性通用检测引物和A型检测引物,以及不同荧光素标记的MGB探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了FMDV通用型和A型二重实时荧光RT-PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法,对123份疑似FMDV感染的临床样品进行了检测。结果显示,建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法在10~1~10~7拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系;对pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重组质粒出现阳性扩增信号,但对正常细胞培养物对照和其他7种病原对照未扩增出特异性曲线;自123份疑似FMDV感染样品中,检出10份FMDV-T阳性,6份FMDV-T/FMDV-A双阳性并且与基因测序结果一致。结果表明,本研究建立的FMDV通用型、A型二重实时荧光RT-PCR检测方法重复性好、敏感性高、特异性强,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,可用于FMDV的快速分型检测,为FMDV的早期检测及临床诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 二重实时荧光RT-pcr 检测方法
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毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立 被引量:1
8
作者 高光平 朱利霞 +2 位作者 王洪彬 赵希艳 王双月 《动物医学进展》 北大核心 2019年第6期12-16,共5页
为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PC... 为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。 展开更多
关键词 毛皮动物 大肠埃希菌 毒力基因 二重pcr检测方法
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产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性双重荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量:4
9
作者 张蓉蓉 张腾飞 +4 位作者 艾地云 罗青平 温国元 王红琳 邵华斌 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第1期167-170,共4页
为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序... 为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序列的克隆载体作为标准品,进行系列条件优化及特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明:该方法具有很好的特异性和重复性,外毒素cpa的灵敏度为1.5×10^(-2)ng/m L,且在1.5×104~1.5×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.991;肠毒素cpe的灵敏度为1.8×10^(-2)ng/m L,且在1.8×103~1.8×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.996;该方法对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌核苷酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;同时对实验室保存的临床分离的疑似菌株用建立的荧光定量方法进行检测,结果临床分离菌株均为A型产气荚膜梭菌。说明该双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强和重复性好。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 外毒素cpa 肠毒素cpe 双重荧光定量pcr 条件优化 方法建立
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二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法 被引量:19
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作者 袁青 殷幼平 +1 位作者 王中康 黄振霖 《植物检疫》 2005年第3期135-138,共4页
本研究采用传统的蛋白酶K法和病毒RNA简易浸提法,从马铃薯块茎、茎干、叶梗、叶片中提取马铃薯X病毒,马铃薯Y病毒,马铃薯A病毒及马铃薯卷叶病毒RNA ,并设计了4种马铃薯病毒引物,优化了二重RT PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,扩... 本研究采用传统的蛋白酶K法和病毒RNA简易浸提法,从马铃薯块茎、茎干、叶梗、叶片中提取马铃薯X病毒,马铃薯Y病毒,马铃薯A病毒及马铃薯卷叶病毒RNA ,并设计了4种马铃薯病毒引物,优化了二重RT PCR反应条件,可以同步扩增出上述4种病毒,扩增产生的靶带分别为562bp(PVX)、480bp(PVY)、3 3 6bp(PLRV)、2 55bp(PVA)。应用病毒RNA简易制样技术和优化的二重RT PCR反应条件,可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此研究还可适合于检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。 展开更多
关键词 pcr快速检测 RT-pcr 马铃薯卷叶病毒 马铃薯X病毒 马铃薯Y病毒 马铃薯A病毒 马铃薯病毒病 反应条件 马铃薯块茎 RNA 制样技术 自然感染 脱毒种薯 浸提法 蛋白酶 试管苗 优化 同步 茎干 田间
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鉴别猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法的建立及初步应用 被引量:7
11
作者 练斯南 梁淋 +1 位作者 白挨泉 崔尚金 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第5期1169-1175,共7页
为了检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法.针对PRV gE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度(50... 为了检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法.针对PRV gE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度(50~60℃,按照1℃递增)、引物浓度(0.2~1.4 μL,依次增加0.2μL)的优化,结果表明,双重PCR反应的最佳退火温度为56℃、最适引物添加量为1 μL.特异性试验结果表明,该方法可以扩增出PRV gE(316 bp)和gB(432 bp)的目的片段,对PCV2、PTV、CSFV、PPV、PRRSV、大肠杆菌的DNA或eDNA均无扩增.敏感性试验结果表明,PRV gE和gB的最低核酸检出量分别为4.4×103和3.3×103拷贝/μL,与单一PCR方法的敏感性相近.应用该方法对广东、广西地区临床送检的56份组织样品进行检测,检测结果显示,强毒感染阳性率为53.6%(30/56),阴性率为46.4%(26/56),未发现有弱毒感染. 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 双重pcr 检测方法
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鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒双重PCR检测方法的建立 被引量:2
12
作者 林而舒 卓玉琛 +4 位作者 陈斌 林煜 钟全福 樊海平 曾占壮 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1394-1399,共6页
【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重PCR法。【方法】优选PCR引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重PCR检测方法,探究双重PCR扩增条件,并检验该方法的... 【目的】建立能同时检测鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AHV)与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的双重PCR法。【方法】优选PCR引物组合,建立鳗鲡疱疹病毒与鳗鲡圆环病毒的双重PCR检测方法,探究双重PCR扩增条件,并检验该方法的特异性、灵敏性和临床样品检测效果。【结果】双重PCR法同时扩增出鳗鲡疱疹病毒690 bp和鳗鲡圆环病毒338 bp特异性片段,与猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)和鲤疱疹病毒(Cyprinid herpesvirus)的核酸不发生扩增反应。鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒重组质粒标准品的最低全检出量为5.0×10^(-4)μg·mL^(-1)。用所建立的双重PCR方法对50份临床病鳗进行检验,其中鳗鲡疱疹病毒的感染率为16%,鳗鲡圆环病毒的感染率为68%,共感染率为8%。该感染率与单一PCR检测结果完全一致。【结论】建立的鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒双重PCR检测法不仅特异性强、灵敏度高、重复性好,而且临床应用效果佳,为鳗鲡疱疹病毒和鳗鲡圆环病毒的快速检测提供了有效的技术支持。 展开更多
关键词 鳗鲡疱疹病毒 鳗鲡圆环病毒 双重pcr 检测方法
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猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立 被引量:5
13
作者 赵宇 崔建涛 +4 位作者 田润博 韩昊莹 郑慧华 刘芳 陈红英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期9-13,共5页
为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物... 为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒3型 双重pcr检测方法
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猪圆环病毒2型和弓形虫双重PCR检测方法的建立及应用 被引量:1
14
作者 朱桓奕 罗亮 +7 位作者 张璇 李照伟 浦同灿 王慧 曾红 杨晓伟 刘霞 赵光伟 《中国动物检疫》 CAS 2022年第11期111-114,120,共5页
为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和弓形虫(Toxoplasma gondii)的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳... 为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和弓形虫(Toxoplasma gondii)的双重PCR方法,根据GenBank上已登录的PCV2和弓形虫基因的保守序列,设计了2对特异性引物,并对反应体系及条件进行了优化。首先对单一PCR检测条件进行摸索,确定其最佳检测条件和灵敏性;进而建立两种病原的双重PCR检测方法,通过对退火温度、灵敏性和特异性进行测试,最终确定该方法的反应体系及条件。结果显示:双重PCR方法对PCV2和弓形虫的最低检出限分别为78.16和29.19μg/mL;对伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等均无扩增,特异性良好。利用该方法对来自川渝地区部分猪场的63份临床样本进行检测,并与单一PCR检测结果进行比对,两种方法的符合率为100%。以上结果说明,本试验建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性强、结果可靠、方便经济,可用于PCV2和弓形虫的实验室快速检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 弓形虫 双重pcr 检测方法 应用
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强、弱毒力新城疫病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量:6
15
作者 王珂 袁乾亮 +8 位作者 尹仁福 薛聪 钱晶 穆昱 张平仄 杨明曦 张晟 韩丽 丁壮 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期1-6,17,共7页
通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探针组和NDV-F、NDV-R引物组,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作为定量检测的标准品,建立检测方法... 通过比对新城疫病毒强、弱毒株F基因序列,根据其在F0裂解位点的差异以及F基因保守序列设计合成NDV-V-probe和NDV-L-probe探针组和NDV-F、NDV-R引物组,以基因Ⅶ型NA-1株和基因Ⅱ型LaSota疫苗株病毒RNA作为定量检测的标准品,建立检测方法。对所建立的标准曲线进行分析,相关系数R2均为0.997,线性关系良好。通过计算变异系数CV/%分别为0.034%和0.027%,均小于1%,说明稳定性良好。对禽类常见病毒IBV、H9亚型AIV检测未发现有交叉反应,特异性好、重复性佳。结果表明:成功建立了新城疫病毒强、弱毒双重荧光定量RT-PCR的检测方法,实现了从分子水平上快速鉴别强、弱毒力的新城疫病毒,也可快速区分野毒感染动物和疫苗接种动物,减少不必要的经济损失。 展开更多
关键词 新城疫强 弱毒 F基因 双重荧光定量RT—pcr 检测方法
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炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用 被引量:2
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作者 王素华 帅江冰 +4 位作者 李舟 袁淑辉 吴绍强 吕继洲 赵治国 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1658-1665,共8页
为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床... 为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL^-1,标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。 展开更多
关键词 炭疽杆菌 BA5345基因 PA基因 双重荧光定量pcr 检测方法
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基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立 被引量:8
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作者 曾繁聪 姜含雨 +7 位作者 辛宁 柯骏鸿 罗瑞 何淑仪 张桂红 马春全 黄淑坚 陈耀 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期952-957,共6页
为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲... 为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重Taq Man荧光定量PCR方法。绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R^(2)均在0.99以上,扩增效率E为88%~90%。表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系。特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×10^(2)拷贝/μL和4.09×10^(2)拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4%,重复效果好。分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品。ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品。二者的总符合率达94.7%,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好。本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 双重荧光定量pcr 检测方法
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猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量:4
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作者 张宏伟 王建华 +3 位作者 陈本龙 麻丽丹 宋喆 蒲静 《中国动物检疫》 CAS 2020年第9期106-112,共7页
为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评... 为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%~1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 牛病毒性腹泻病毒 双重荧光RT-pcr 检测方法
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H4亚型和N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 罗思思 谢芝勋 +10 位作者 李孟 黄娇玲 李丹 谢丽基 张民秀 曾婷婷 王盛 张艳芳 范晴 谢志勤 邓显文 《中国动物检疫》 CAS 2020年第1期69-73,共5页
为建立一种简单、快速鉴别H4亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的保守区域,分别设计筛选出1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型和N2亚型AIV二重RT-PCR检测方法。该法可特异性扩增H4... 为建立一种简单、快速鉴别H4亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因和N2亚型AIV NA基因的保守区域,分别设计筛选出1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型和N2亚型AIV二重RT-PCR检测方法。该法可特异性扩增H4亚型和N2亚型AIV,对其他亚型AIV和常见禽病病原体无交叉反应;对H4亚型和N2亚型AIV的检测下限均为104拷贝/μL;对152份临床样品的检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的二重RT-PCR方法为H4亚型和N2亚型AIV的诊断提供了快速、特异、敏感和有效的检测方法。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H4亚型 N2亚型 二重RT-pcr 检测方法
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拉克罗斯病毒和雪靴野兔病毒双重RT-PCR方法的建立
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作者 白红岩 孙肖红 +3 位作者 林二妹 陈倩 甄维 徐宝梁 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2014年第3期163-166,共4页
目的建立针对拉克罗斯病毒(LAC)和雪靴野兔病毒(SSH)的双重RT-PCR检测方法。方法分别针对LAC和SSH病毒的S基因设计2对特异性引物,建立同时检测LAC和SSH的双重RT-PCR方法。以黄病毒属的黄热病毒(YFV)、库京病毒(KUNV)、登革病毒(DENV)、... 目的建立针对拉克罗斯病毒(LAC)和雪靴野兔病毒(SSH)的双重RT-PCR检测方法。方法分别针对LAC和SSH病毒的S基因设计2对特异性引物,建立同时检测LAC和SSH的双重RT-PCR方法。以黄病毒属的黄热病毒(YFV)、库京病毒(KUNV)、登革病毒(DENV)、乙型脑炎病毒(JEV),布尼亚病毒属的塔希纳病毒(TAHV)和甲病毒属的巴马哈森林病毒(BFV)、玛雅罗病毒(MAYV)、盖塔病毒(GETV)为模板验证方法的特异性,以不同拷贝数的病毒RNA检测该方法的敏感性。结果建立的双重RT-PCR方法能同时扩增到LAC和SSH的目的片段;敏感度分别达到LAC1.41×105copies/μl,SSH 5.6×104copies/μl;与YFV、KUNV、BFV、MAYV无交叉反应。结论建立了双重RT-PCR方法,可用于LAC和SSH病毒的快速检测。 展开更多
关键词 拉克罗斯病毒 雪靴野兔病毒 双重RT—pcr 检测 方法
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