人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性 被引量：5

1

作者 陈巧林 任宏伟 +2 位作者 康巧华 王宗元 茹炳根 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期606-611,共6页

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表... 以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2 展开更多

关键词 人细胞核 dutpase 克隆 表达 酶学活性 dUTP焦磷酸酶 亲和层析

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鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析 被引量：4

2

作者 招丽婵 程安春 +6 位作者 汪铭书 袁桂萍 贾仁勇 周登春 葛菡 孙涛 陈孝跃 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1087-1093,共7页

根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示... 根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66.8 ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接ELISA效价为1∶409 600。通过免疫荧光技术进行DPV dUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4 h的胞质中检测到特异性荧光,12 h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24 h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48 h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPV dUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 dutpase基因 克隆 表达 亚细胞定位

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猪囊尾蚴dUTPase的同源建模及分析 被引量：6

3

作者 刘振勇 才学鹏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期742-745,共4页

通过SWISS-MODEL服务器对猪囊尾蚴dUTPase(Cysticercus cellulosae dUTPase,CY dUT-Pase)进行同源建模,用SPDBV和DSViewer对模型进行修饰,模型经WHATIF服务器进行质量评估。对已知dUTPase的晶体结构分析后,推测CY dUTPase属于同源三聚体... 通过SWISS-MODEL服务器对猪囊尾蚴dUTPase(Cysticercus cellulosae dUTPase,CY dUT-Pase)进行同源建模,用SPDBV和DSViewer对模型进行修饰,模型经WHATIF服务器进行质量评估。对已知dUTPase的晶体结构分析后,推测CY dUTPase属于同源三聚体,通过SymmDock服务器进行CYdUTPase三聚物的分子对接,并与人dUTPase 3D结构叠合。结果表明,建立的CYdUTPase 3D模型是成功的,具有良好的真实性,CYdUTPase三级结构的预测为此酶的结构功能研究和新型抗囊虫药物的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 dutpase 同源建模 模型分析

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口疮病毒dUTPase基因的原核表达及亚细胞定位 被引量：1

4

作者 刘伟 杨侃侃 +6 位作者 殷冬冬 王元红 俞赵荣 蒋书东 李传峰 李永东 王勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期818-823,共6页

为了对口疮病毒（orf virus,ORFV）的dUTPase基因进行原核表达和亚细胞定位研究,本研究利用PCR扩增获得dUTPase基因,通过亚克隆获得重组表达质粒p ET-32a-dUTPase和p EGFP-C3-dUTPase。p ET-32a-dUTPase经IPTG诱导表达出dUTPase蛋白。... 为了对口疮病毒（orf virus,ORFV）的dUTPase基因进行原核表达和亚细胞定位研究,本研究利用PCR扩增获得dUTPase基因,通过亚克隆获得重组表达质粒p ET-32a-dUTPase和p EGFP-C3-dUTPase。p ET-32a-dUTPase经IPTG诱导表达出dUTPase蛋白。蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。p EGFP-C3-dUTPase转染BHK21细胞,利用荧光显微镜观察dUTPase蛋白的亚细胞定位。结果表明,dUTPase蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,分子质量大小约为35.7 ku,与预期相符。表达的dUTPase His融合蛋白能够与His标签的单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。琼脂扩散试验结果显示抗体效价为1∶8。真核表达的dUTPase蛋白在转染的BHK21细胞中主要分布在细胞质中。本研究结果为进一步研究dUTPase蛋白的功能奠定了一定的理论基础。 展开更多

关键词 口疮病毒 dutpase基因 原核表达 亚细胞定位

原文传递

猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达 被引量：1

5

作者 张艳 乔军 +3 位作者 才学鹏 景志忠 骆学农 王笑笑 《动物医学进展》 CSCD 2007年第6期10-13,共4页

采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确。用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时... 采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确。用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR技术确定目的蛋白的表达情况。结果表明,在转染重组质粒48 h后能观察到绿色荧光,表明在BHK细胞中成功地表达了猪带绦虫dUTPase与pGFP-C1的融合蛋白,为下一步重组dUTPase酶活性的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 猪带绦虫 六钩蚴 dutpase 重组质粒 转染

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金属硫蛋白-3对dUTPase调节dUTP细胞毒性作用的影响

6

作者 陈巧林 康巧华 +2 位作者 任宏伟 王宗元 茹炳根 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期389-393,共5页

金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,是一种脑特异性金属硫蛋白。人细胞核dUTP焦磷酸酶(dUTPpyrophosphatase,dUTPase)是最近在脑中研究发现的能与人金属硫蛋白 3(humanmetallothionein 3,hMT 3)相互作用的一个蛋白 ,两者共同... 金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,是一种脑特异性金属硫蛋白。人细胞核dUTP焦磷酸酶(dUTPpyrophosphatase,dUTPase)是最近在脑中研究发现的能与人金属硫蛋白 3(humanmetallothionein 3,hMT 3)相互作用的一个蛋白 ,两者共同作用具有神经元生长抑制活性。为了探讨hMT 3对dUTPase调节dUTP引起的细胞毒性作用的影响 ,通过基因转染HEK2 93细胞观察细胞在dUTP中的生长情况 ,发现共转染hMT 3和dUTPase基因的细胞比单转染dUTPase或hMT 3基因的细胞具有更强的对dUTP细胞毒性的耐受能力 ;同时在大肠杆菌BL2 1中表达重组蛋白 ,测定hMT 3在dUTPase水解dUTP中的作用 ,结果显示重组蛋白hMT 3可以促进dUTPase对dUTP的水解。结果均初步证实了hMT 3对dUTPase抵抗dUTP引起的正常细胞死亡有一定的协同作用 ,为进一步研究dUTPase及其相互作用蛋白hMT 3在化疗中的应用提供理论依据。 展开更多

关键词 hMT-3 dutpase 基因转染 dUTP 细胞毒性

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RNAi沉默dUTPase对SW620细胞黏附的影响

7

作者 赖晓嵘 童华生 +2 位作者 武金宝 何美蓉 姜泊 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期698-700,共3页

目的采用RNAi沉默dUTPase的表达,观察SW620细胞黏性的改变。方法合成两条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle载体中,构建重组质粒sidUTPase/pSilenCircle和无关基因的重组质粒siFly/pSilenCircle。以上述重组质粒分... 目的采用RNAi沉默dUTPase的表达,观察SW620细胞黏性的改变。方法合成两条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle载体中,构建重组质粒sidUTPase/pSilenCircle和无关基因的重组质粒siFly/pSilenCircle。以上述重组质粒分别转染SW620细胞,RT-PCR和Westernblot检测dUTPase的表达,异质黏附实验分析细胞黏附性的改变。结果成功地构建了2个dUTPase发夹siRNA的真核表达载体sidUTPase/pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly/pSilenCircle。与siFly/pSilen-Circle转染组比较,sidUTPase/pSilenCircle转染组SW620细胞dUTPase的表达明显下调,细胞异质黏附能力减弱。结论构建的dUTPase发夹siRNA的真核表达载体sidUTPase/pSilenCircle可有效抑制SW620细胞的dUTPase表达,降低细胞的异质黏附性。 展开更多

关键词 RNA干扰 dutpase 载体构建 细胞黏附

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多头带绦虫dUTPase基因的原核表达、组织定位及酶学活性分析

8

作者 黄兴 徐璟 +6 位作者 王宇 杨应东 万洁 郭承 古小彬 谢跃 杨光友 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期2374-2382,共9页

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为44... 探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为447bp,编码148个氨基酸,预测的蛋白质分子大小为16.39ku,等电点为6.263;与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPase基因的氨基酸序列相似性分别为97%和91%。原核表达的TmdUTPase为可溶性蛋白,纯化后的蛋白质质量浓度为0.907mg·mL^(-1),Western blot分析显示,该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别,具有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区,同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29U·mg^(-1),EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性,而金属离子Mg^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)能够增强Tm-dUTPase活性。上述结果为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 多头带绦虫 dutpase基因 原核表达 酶学活性分析 免疫荧光定位

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鸭瘟病毒dUTPase基因的分子特性及转录时相分析

9

作者 招丽婵 袁桂萍 +5 位作者 程安春 汪铭书 贾仁勇 周登春 陈虹 葛菡 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1088-1094,共7页

应用大量生物信息学分析工具及 RNA 斑点杂交技术对本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv 株基因文库时新发现的 dUTPase 基因(GenBank 登录号DQ486149)进行了分子特性及转录时相分析。研究表明:该基因大小为1344bp,编码447... 应用大量生物信息学分析工具及 RNA 斑点杂交技术对本实验室构建鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)CHv 株基因文库时新发现的 dUTPase 基因(GenBank 登录号DQ486149)进行了分子特性及转录时相分析。研究表明:该基因大小为1344bp,编码447个氨基酸,包含 dUTPase 家族蛋白的5个保守 motifs,排列形式3-l-2-4-5具备Ⅱ型 dUTPase的典型特征。DPV CHv dUTPase 基因在25个疱疹病毒参考株之间高度保守,并与 a 疱疹病毒的氨基酸同源性较之与β、γ疱疹病毒要高。DPV CHv dUTPase基因转录检测发现DPV 感染宿主细胞后最早30rain 可检测到该基因转录产物,随后转录产物量迅速放大,4h达高峰,24h 后下降至相对低的水平。该研究为阐明病毒基因表达调控机理提供了有用的实验数据,并对病毒其他基因的发现和研究具有指导性意义。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 dutpase 分子特性 转录分析 斑点杂交

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马传染性贫血病毒强、弱毒株dUTPase结构与酶活性比较

10

作者 阎玉河 邵一鸣 +2 位作者 潘品良 贾斌 沈荣显 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期148-153,共6页

为研究尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)在马传染性贫血病毒(equineinfectousanemiavirus,EIAV)致弱过程中的作用,探索dUTPase结构与功能的关系,分别对EIAV强、弱毒株dUTPase的编码基因进行了结构分析,并在大肠杆菌中进行了表达。经... 为研究尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)在马传染性贫血病毒(equineinfectousanemiavirus,EIAV)致弱过程中的作用,探索dUTPase结构与功能的关系,分别对EIAV强、弱毒株dUTPase的编码基因进行了结构分析,并在大肠杆菌中进行了表达。经镍-次氮基三乙酸(Ni NTA)金属亲合层析方法对表达产物纯化后,用3H标记底物的方法测定了重组强、弱毒株dUTPase的活性。证明所表达的两种重组dUTPase均具有水解dUTP的功能,但重组弱毒株dUTPase的活性显著高于重组强毒株dUTPase的活性。结果提示,由于EIAV疫苗株在驴白细胞上连续传代培养,使病毒dUTPase的活性增强和复制能力提高,而决定酶活性改变的分子基础是dUTPase编码基因中的两个氨基酸发生了突变。此结果对其它慢病毒病的免疫预防具有重要参考价值。 展开更多

关键词 马传染性贫血病毒 毒株 尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶 dutpase 酶活性

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dUTPase在胃癌中的表达及其对癌细胞增殖、迁移的影响

11

作者 蒋振 谢杰斌 +3 位作者 肖杨 罗瑶敏 魏晨 袁晓霞 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2022年第10期1885-1895,共11页

脱氧尿苷三磷酸核苷酸水解酶(deoxyuridine 5’-triphosphate nucleotidohydrolase,dUTPase)是由DUT基因编码的DNA合成过程中的关键酶。研究显示其在维护基因组稳定性过程中充当基因组管家的作用,而其在胃癌中的表达及作用尚不清楚。该... 脱氧尿苷三磷酸核苷酸水解酶(deoxyuridine 5’-triphosphate nucleotidohydrolase,dUTPase)是由DUT基因编码的DNA合成过程中的关键酶。研究显示其在维护基因组稳定性过程中充当基因组管家的作用,而其在胃癌中的表达及作用尚不清楚。该研究首先利用iTRAQ标记的定量蛋白组学从胃癌组织样本中鉴定出dUTPase高表达,经TIMER数据库分析得出dUTPase在胃癌中高表达,并经实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)等方法检测显示,dUTPase在胃癌组织中显著高表达,且其表达与组织学分级及TNM分期等临床病理因素相关。预后分析结果显示:dUTPase高表达与胃癌患者的首次进展生存期(first progression survival,FP)、总生存期(overall survival,OS)、复发后生存期(post progression survival,PPS)及HER2阳性状态显著相关。基因富集分析(gene set enrichments analysis,GSEA)结果显示:DUT高表达胃癌患者中有185条信号通路显著被激活,涉及DNA合成、DNA修复及基因组稳定性等多个方面。一系列体外功能实验结果显示,体外抑制DUT基因表达可显著抑制胃癌细胞的增殖及体外迁移。总之,该研究证实了dUTPase在胃癌中显著高表达,其表达可能与多条参与DNA合成、修复及基因组稳定性的肿瘤信号通路相关,靶向dUTPase可显著抑制胃癌细胞的增殖及迁移。 展开更多

关键词 dutpase GSEA 增殖 迁移 胃癌

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慢病毒dUTPase结构与功能的研究进展 被引量：1

12

作者 阎玉河 邵一鸣 《国外医学（病毒学分册）》 2001年第2期33-37,共5页

d UTPase是生物体遗传和基因复制的重要水解酶 ,它可以防止 d UTP在 DNA合成中的插入和错配 ,维持 DNA复制的保真性和降低生物体发生突变的频率 ;同时还为 DNA的合成提供必需的原料。对于慢性病毒来说 ,它还是构成病毒毒力及病毒高效复... d UTPase是生物体遗传和基因复制的重要水解酶 ,它可以防止 d UTP在 DNA合成中的插入和错配 ,维持 DNA复制的保真性和降低生物体发生突变的频率 ;同时还为 DNA的合成提供必需的原料。对于慢性病毒来说 ,它还是构成病毒毒力及病毒高效复制的因素。因此 ,d UTPase可用于抗肿瘤细胞和抗病毒药物的筛选。本文对 d UTPase的分布和进化关系、结构与功能的研究进展进行了概述。 展开更多

关键词 慢病毒 dutpase 结构 分布 功能 EIAV FIV CAEV

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嗜酸热古菌病毒STSV2密码子偏嗜性及其对dUTPase外源表达的影响 被引量：2

13

作者 谷丰 朱国东 +3 位作者 张琦 季秀玲 魏云林 林连兵 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期33-38,共6页

病毒和宿主之间的密码子使用频率差异是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一。利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计病毒STSV2及其宿主Sulfolobussolfataricus P2中的6个不同基因的遗传密码偏嗜性,并对病毒STSV2的dUTPase在大肠杆菌BL21... 病毒和宿主之间的密码子使用频率差异是病毒在宿主中生存的重要调控机制之一。利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计病毒STSV2及其宿主Sulfolobussolfataricus P2中的6个不同基因的遗传密码偏嗜性,并对病毒STSV2的dUTPase在大肠杆菌BL21和Rosetta中分别进行外源表达并分析其差异。结果表明,病毒STSV2密码子的偏嗜性总体与其宿主菌P2相似,STSV2基因组的不同蛋白编码基因的密码子偏嗜性有区别,病毒和宿主的相似蛋白编码序列密码子偏嗜性也有差异。分别以BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为宿主表达STSV2的dUTPase基因显示,以BL21(DE3)为宿主时表达量大于以Rosetta(DE3)为宿主时目的蛋白表达量,进一步说明了病毒STSV2的密码子的偏嗜性对其蛋白的外源表达影响。 展开更多

关键词 密码子偏嗜性 尿嘧啶脱氧核酸核苷三磷酸酶(dutpase) 病毒STSV2 基因外源表达

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超嗜热古菌Palaeococcus pacificus PolB DNA聚合酶和dUTPase在PCR反应中的应用

14

作者 陈孜孟 赵文昭 +2 位作者 解兵斌 崔治中 李卓 《应用海洋学学报》 CSCD 北大核心 2016年第2期198-204,共7页

为了获取具有广泛适用性的DNA聚合酶,将深海热液区获得的超嗜热古菌Palaeococcus pacificus DY20341的Pol B DNA聚合酶和d UTPase进行原核表达和纯化,将得到的Pol B DNA聚合酶及d UTPase混合后用于扩增古菌、细菌和真核生物的基因.通过... 为了获取具有广泛适用性的DNA聚合酶,将深海热液区获得的超嗜热古菌Palaeococcus pacificus DY20341的Pol B DNA聚合酶和d UTPase进行原核表达和纯化,将得到的Pol B DNA聚合酶及d UTPase混合后用于扩增古菌、细菌和真核生物的基因.通过PCR反应成功地扩增了商业化Pfu DNA聚合酶所不能扩增的Palaeococcus pacificus DY2034的琼脂酶基因.由此可知,尽管商业化的DNA聚合酶多种多样,针对不同扩增目的片段所需的特异DNA聚合酶体系仍然是必要的,这是又一嗜热古菌B家族DNA聚合酶应用的报道. 展开更多

关键词 海洋生物学 Palaeococcus pacificus PolB DNA聚合酶 dutpase 原核表达 PCR

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神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性 被引量：2

15

作者 陈巧林 康巧华 +2 位作者 任宏伟 王宗元 茹炳根 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第1期7-12,共6页

为了探讨神经生长抑制因子 (Neuronalgrowthinhibitoryfactor,GIF)与Alzheimer’s病 (Alzheimer’sdisease,AD)的关系 ,将GIF的cDNA全基因克隆到载体pHyblex中 ,运用酵母双杂交系统从Alzheimer’s病人脑cDNA文库中筛选出与GIF相互作用... 为了探讨神经生长抑制因子 (Neuronalgrowthinhibitoryfactor,GIF)与Alzheimer’s病 (Alzheimer’sdisease,AD)的关系 ,将GIF的cDNA全基因克隆到载体pHyblex中 ,运用酵母双杂交系统从Alzheimer’s病人脑cDNA文库中筛选出与GIF相互作用蛋白的cDNA克隆。免疫共沉淀和蛋白质印迹实验进一步验证了该蛋白在体内与GIF相互作用的特异性。克隆并鉴定了其中 1个与GIF特异性结合的蛋白 ,与人细胞核dUTP焦磷酸酶 (DUT)同源。进一步构建了重组表达质粒pGEX 4T 1 DUT ,转化大肠杆菌BL2 1,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析、凝血酶酶切和SephacrylS10 0纯化 ,得到纯度 95 %以上的dUTPase蛋白。体外生物学活性检测表明 ,表达的dUTPase蛋白可以与GIF共同作用嗜铬细胞瘤株 (pheochromocytoma)PC12 ,对细胞的生长产生抑制作用。 展开更多

关键词 生长抑制因子 Alzheimer's症 酵母双杂交系统 dutpase 基因表达 嗜铬细胞瘤株

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一株新的重组蛙病毒Δ67R-RGV的构建及基因67R的初步功能鉴定 被引量：3

16

作者 黄星 裴超 +1 位作者 何利波 张奇亚 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期495-501,共7页

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功... 沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能。首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中。利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(Δ67R-RGV)。经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒Δ67R-RGV。再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和Δ67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测。结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在Δ67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点。进一步分别测定了wt-RGV与Δ67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因。 展开更多

关键词 重组虹彩病毒 沼泽绿牛蛙病毒(RGV) 尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dutpase) 基因缺失 一步生长曲线

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利用酵母双杂交技术筛选与wsv112互作的宿主蛋白 被引量：2

17

作者 王中一 刘庆慧 +1 位作者 卢翠玉 黄倢 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第4期156-162,共7页

对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系,本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的... 对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系,本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的候选蛋白。以WSSV为模板,构建pGBKT7-112诱饵载体,转化到Y2H Gold酵母菌感受态细胞中,转化菌液涂布到不同缺陷型培养基上,检测诱饵载体的自激性和毒性。将凡纳滨对虾肠道cDNA文库与诱饵菌株pGBKT7-112接合,通过筛选力度不同的缺陷型培养基、颜色反应、PCR、测序鉴定等步骤筛选阳性克隆,将阳性菌株提取质粒,再经过回复杂交实验验证筛选出的阳性质粒与诱饵载体的作用。研究表明,诱饵载体pGBKT7-112无自激性和毒性,可用于酵母双杂交实验;经初筛和回复杂交实验最终得到2个阳性质粒,经过NCBI数据库对比,其编码的蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus) C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%同源性。本研究为wsv112的调控机制提供新的线索。 展开更多

关键词 对虾白斑综合征病毒 wsv112 dutpase 酵母双杂交

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