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蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法的建立及其评价
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作者 杨继飞 潘蓓珍 +6 位作者 刘岩 周钰娇 杨建宇 张先宇 丁文博 李昊宇 孙丽媛 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第2期516-525,共10页
目的:采用聚合酶链式反应(PCR)和胶体金技术建立1种蜡样芽孢杆菌cytK和nhe2种毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。方法:采用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌DNA,以蜡样芽孢杆菌细胞毒素cytK和... 目的:采用聚合酶链式反应(PCR)和胶体金技术建立1种蜡样芽孢杆菌cytK和nhe2种毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。方法:采用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌DNA,以蜡样芽孢杆菌细胞毒素cytK和非溶血性肠毒素nhe为靶基因设计特异性引物,通过克隆转化鉴定PCR产物,确定胶体金标记链霉亲和素、质量控制线(C线)、cytK检测线(T_(1))和nhe检测线(T_(2))最佳标记量,组装核酸试纸条并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。结果:蜡样芽孢杆菌DNA浓度为248 mg·L^(-1),纯度为1.8~2.0;经克隆转化和测序比对,PCR产物与GenBank数据库中已登记的蜡样芽孢杆菌cytK和nhe相似性均为100%。在pH为7.0的条件下,每200μL胶体金溶液中链霉亲和素最佳标记量为6.0μL;质量控制线(C线)最佳标记量为2.00 g·L^(-1),cytK基因检测线(T1)最佳标记量为0.550 g·L^(-1),nhe基因检测线(T_(2))最佳标记量为0.2 g·L^(-1)。特异性检测,仅蜡样芽孢杆菌组显示阳性结果,试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌无交叉反应,与电泳结果一致;灵敏度检测,当双重核酸试纸条中蜡样芽孢杆菌DNA浓度降至10^(-2)mg·L^(-1)时,可观察到C线、T1线和T_(2)线3个条带,检测限为琼脂糖凝胶电泳(10^(-1)mg·L^(-1))的1/10;重复性检测,由不同实验室不同人员对试纸条进行验证,结果一致;稳定性检测,在第6、9和12个月进行试纸条稳定性验证,稳定性良好。结论:本研究建立的双重核酸试纸条法可以同时检测蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因,灵敏度高,特异性强,可实现快速可视化检测。 展开更多
关键词 蜡样芽孢杆菌 cytk NHE 双重核酸试纸条
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PCR法快速鉴定眼源性蜡样芽胞杆菌 被引量：3
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作者 袁珊珊 楼永良 +5 位作者 钟毓红 毛丽萍 吴娅娅 陈静思 沙栋杰 郑美琴 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2012年第3期273-277,282,共6页
目的建立一种快速、灵敏、特异的眼源性蜡样芽胞杆菌PCR检测方法,为蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者的快速诊断提供依据。方法选择编码蜡样芽胞杆菌细胞毒素的cytK为靶基因设计引物,建立检测眼源性蜡样芽胞杆菌PCR;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴... 目的建立一种快速、灵敏、特异的眼源性蜡样芽胞杆菌PCR检测方法,为蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者的快速诊断提供依据。方法选择编码蜡样芽胞杆菌细胞毒素的cytK为靶基因设计引物,建立检测眼源性蜡样芽胞杆菌PCR;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,基因序列与GenBank比对验证扩增产物;将计数过的5株蜡样芽胞杆菌菌悬液,梯度稀释后分别提取DNA进行PCR扩增,确定检测方法的灵敏度;分别用眼部常见感染菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、化脓性链球菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌和白假丝酵母菌以及枯草芽胞杆菌DNA进行特异性试验;进一步将该方法应用到人工污染致病蜡样芽胞杆菌的房水标本中,并分析其灵敏度。结果 5株分离自眼内炎患者标本中的蜡样芽胞杆菌均扩增出360 bp左右的DNA片段,测序结果与GenBank比对一致;该法检测在5 h内完成,方法灵敏度达7.5～15.0 CFU/mL;其他菌株检测未出现非特异性扩增;对模拟感染房水标本的PCR鉴定结果与分离培养对比,二者符合率为100%,模拟标本的检测灵敏度与纯菌结果一致。结论 cytK基因为靶基因的PCR用于眼源性蜡样芽胞杆菌的快速检测,具有简便、快速、敏感、特异等特点,为眼内炎患者的快速诊断提供依据,在实际检验工作中有良好的应用前景。 展开更多
关键词 蜡样芽胞杆菌 cytk基因 聚合酶链式反应 眼内炎 快速检测
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