目的基于AMPK介导的线粒体自噬方面探究国医大师王琦院士研发的治疗男性不育的国家中药三类新药黄精赞育胶囊治疗少弱精子症细胞层面的分子机制。方法选择丙烯醛(acrolein,ACR)作用于GC-2spd(ts)小鼠精母细胞制作少弱精子症细胞模型,通...目的基于AMPK介导的线粒体自噬方面探究国医大师王琦院士研发的治疗男性不育的国家中药三类新药黄精赞育胶囊治疗少弱精子症细胞层面的分子机制。方法选择丙烯醛(acrolein,ACR)作用于GC-2spd(ts)小鼠精母细胞制作少弱精子症细胞模型,通过CCK8细胞活性检测确定后续造模用ACR浓度和造模时间。造模成功后加入不同浓度含黄精赞育胶囊的完全培养基进行细胞培养,于24 h后CCK8细胞活性检测,根据细胞活力确定后续给药浓度。GC-2spd细胞贴壁后分为NC组、造模组和ACR+HJZY给药组,通过共聚焦荧光显微镜观测黄精赞育胶囊对线粒体自噬的影响;将上述3组细胞分别转染siRNA-NC和siRNA-AMPK,分为siRNA-NC+control、siRNA-NC+ACR、siRNANC+ACR+HJZY、siRNA-AMPK+control、siRNA-AMPK+ACR、siRNA-AMPK+ACR+HJZY 6组,通过Western blot验证黄精赞育胶囊对AMPK介导的p-AMPK、LC3B、P62、PINK1、Parkin、TBK1、ULK1等线粒体自噬相关蛋白的调控作用。结果通过细胞活性检测实验确定ACR的造模浓度为34μmol/L,造模时间为20 min,HJZY给药浓度为160μmol/L。共聚焦荧光显微镜显示黄精赞育胶囊对受损生精细胞线粒体膜电位具有一定正向调节作用,造模组线粒体膜电位较NC组大幅降低,ACR+HJZY给药组给药后细胞膜电位较造模组有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示siRNA-NC+ACR组p-AMPK/AMPK和PINK1蛋白表达水平较siRNA-NC+control组下降(P<0.001),siRNA-NC+ACR组Parkin蛋白水平较siRNA-NC+control组有所下降,但差异无统计学意义,HJZY给药后这3种蛋白表达水平均较siRNANC+ACR组上升(P<0.001);siRNA-NC+ACR组LC3B、P62、TBK1和ULK1蛋白表达水平均较siRNA-NC+control组上升(P<0.01),siRNA-NC+ACR+HJZY组上述蛋白表达水平均较siRNA-NC+ACR组有所下降(P<0.05)。转染敲减基因siRNAAMPK后,siRNA-AMPK+ACR组p-AMPK/AMPK、PINK1和Parkin蛋白表达水平较siRNA-AMPK+control组有所下降(P<0.01);H J Z Y给药后上述3种蛋白表达水平与s i R N A-A M P K+A C R组比较差异均无统计学意义;s i R N A-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-AMPK+ACR组相比,LC3B蛋白表达水平仍降低(P<0.01),但P62、TBK1和ULK1蛋白表达水平差异均无统计学意义;siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比,p-AMPK/AMPK、ULK1和TBK1蛋白表达水平下降(P<0.001),PINK1蛋白表达水平亦下降(P<0.05),P62蛋白表达水平上升(P<0.001);siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比,TBK1蛋白表达水平下降(P<0.001),LC3B蛋白表达水平下降(P<0.01),ULK1蛋白表达水平亦下降(P<0.05),PINK1和Parkin蛋白表达水平有所下降但差异无统计学意义;siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNANC+ACR+HJZY组相比,p-AMPK/AMPK、PINK1和Parkin蛋白表达水平下降(P<0.05),LC3B蛋白表达水平亦下降(P<0.01),P62蛋白表达水平上升(P<0.001),TBK1和ULK1蛋白表达水平差异无统计学意义。结论黄精赞育胶囊可能通过调节AMPK介导的线粒体自噬达到治疗男性少弱精子症的效果。展开更多
文摘目的基于AMPK介导的线粒体自噬方面探究国医大师王琦院士研发的治疗男性不育的国家中药三类新药黄精赞育胶囊治疗少弱精子症细胞层面的分子机制。方法选择丙烯醛(acrolein,ACR)作用于GC-2spd(ts)小鼠精母细胞制作少弱精子症细胞模型,通过CCK8细胞活性检测确定后续造模用ACR浓度和造模时间。造模成功后加入不同浓度含黄精赞育胶囊的完全培养基进行细胞培养,于24 h后CCK8细胞活性检测,根据细胞活力确定后续给药浓度。GC-2spd细胞贴壁后分为NC组、造模组和ACR+HJZY给药组,通过共聚焦荧光显微镜观测黄精赞育胶囊对线粒体自噬的影响;将上述3组细胞分别转染siRNA-NC和siRNA-AMPK,分为siRNA-NC+control、siRNA-NC+ACR、siRNANC+ACR+HJZY、siRNA-AMPK+control、siRNA-AMPK+ACR、siRNA-AMPK+ACR+HJZY 6组,通过Western blot验证黄精赞育胶囊对AMPK介导的p-AMPK、LC3B、P62、PINK1、Parkin、TBK1、ULK1等线粒体自噬相关蛋白的调控作用。结果通过细胞活性检测实验确定ACR的造模浓度为34μmol/L,造模时间为20 min,HJZY给药浓度为160μmol/L。共聚焦荧光显微镜显示黄精赞育胶囊对受损生精细胞线粒体膜电位具有一定正向调节作用,造模组线粒体膜电位较NC组大幅降低,ACR+HJZY给药组给药后细胞膜电位较造模组有所升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示siRNA-NC+ACR组p-AMPK/AMPK和PINK1蛋白表达水平较siRNA-NC+control组下降(P<0.001),siRNA-NC+ACR组Parkin蛋白水平较siRNA-NC+control组有所下降,但差异无统计学意义,HJZY给药后这3种蛋白表达水平均较siRNANC+ACR组上升(P<0.001);siRNA-NC+ACR组LC3B、P62、TBK1和ULK1蛋白表达水平均较siRNA-NC+control组上升(P<0.01),siRNA-NC+ACR+HJZY组上述蛋白表达水平均较siRNA-NC+ACR组有所下降(P<0.05)。转染敲减基因siRNAAMPK后,siRNA-AMPK+ACR组p-AMPK/AMPK、PINK1和Parkin蛋白表达水平较siRNA-AMPK+control组有所下降(P<0.01);H J Z Y给药后上述3种蛋白表达水平与s i R N A-A M P K+A C R组比较差异均无统计学意义;s i R N A-AMPK+ACR+HJZY组与siRNA-AMPK+ACR组相比,LC3B蛋白表达水平仍降低(P<0.01),但P62、TBK1和ULK1蛋白表达水平差异均无统计学意义;siRNA-AMPK+control组与siRNA-NC+control组相比,p-AMPK/AMPK、ULK1和TBK1蛋白表达水平下降(P<0.001),PINK1蛋白表达水平亦下降(P<0.05),P62蛋白表达水平上升(P<0.001);siRNA-AMPK+ACR组与siRNA-NC+ACR组相比,TBK1蛋白表达水平下降(P<0.001),LC3B蛋白表达水平下降(P<0.01),ULK1蛋白表达水平亦下降(P<0.05),PINK1和Parkin蛋白表达水平有所下降但差异无统计学意义;siRNA-AMPK+ACR+HJZY组与siRNANC+ACR+HJZY组相比,p-AMPK/AMPK、PINK1和Parkin蛋白表达水平下降(P<0.05),LC3B蛋白表达水平亦下降(P<0.01),P62蛋白表达水平上升(P<0.001),TBK1和ULK1蛋白表达水平差异无统计学意义。结论黄精赞育胶囊可能通过调节AMPK介导的线粒体自噬达到治疗男性少弱精子症的效果。
