为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感...为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感染Vero-SN细胞,经过筛选得到ATG5基因敲除的亚克隆细胞系。利用TCID_(50)和Western-blot技术检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)分别在Vero-SN细胞和ATG5基因敲除细胞系中的复制能力。结果表明,本研究成功建立了VeroSN-ATG5KO细胞系,且抑制细胞自噬不利于病毒复制。该基因敲除细胞系的建立为后续探究病毒与自噬蛋白的相互作用及分子机制提供了试验材料。展开更多
文摘为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感染Vero-SN细胞,经过筛选得到ATG5基因敲除的亚克隆细胞系。利用TCID_(50)和Western-blot技术检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)分别在Vero-SN细胞和ATG5基因敲除细胞系中的复制能力。结果表明,本研究成功建立了VeroSN-ATG5KO细胞系,且抑制细胞自噬不利于病毒复制。该基因敲除细胞系的建立为后续探究病毒与自噬蛋白的相互作用及分子机制提供了试验材料。
文摘目的探讨加味丹参饮预处理是否通过调节Beclin-1和Atg5表达调控自噬抗缺血再灌注损伤大鼠心肌。方法将60只健康SD大鼠随机分为空白对照(control group,C)组、假手术(sham,S)组、缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)组、IRI+加味丹参饮(Jiawei Danshen Yin,JDY)组、IRI+JDY+自噬抑制剂(inhibitor,I)组,每组12只。通过结扎-放松大鼠左冠状动脉前降支制备心肌IRI模型。通过氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察心肌梗死面积率;在透射电镜下观察自噬泡;采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测心肌Beclin-1和Atg5 m RNA表达;采用蛋白质印迹(western blot)法检测心肌Beclin-1蛋白表达变化。结果 IRI+JDY组心肌梗死面积率显著低于IRI组及IRI+JDY+I组(P<0.01)。电镜结果显示,IRI+JDY组适度调节大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞的自噬,改善心肌细胞结构。IRI组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较SG组显著升高(P<0.01);IRI+JDY组、IRI+JDY+I组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI组显著降低(P<0.01);IRI+JDY组大鼠心肌细胞中Beclin-1和Atg5 m RNA表达水平及Beclin-1蛋白表达较IRI+JDY+I组显著升高(P<0.01)。结论加味丹参饮通过调节缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达适度,调控缺血再灌注心肌细胞发生适度自噬,从而发挥细胞保护作用。
