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基于盐胁迫构建葡萄酵母cDNA文库及VvRBOHA启动子互作蛋白筛选
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作者 杨文茂 柳成荫 +3 位作者 郭宏扬 陈奥星 许丽丽 王宪璞 《果树学报》 北大核心 2025年第12期2803-2813,共11页
【目的】呼吸爆发氧化酶(respiratory burst oxidase homolog protein,RBOH)是一种酶复合物,其催化作用受RBOHs关键合成基因的限制,同时与氧气消耗的突然增加、活性氧(ROS)积累关系密切,在调控植物的各种发育过程和应激反应中发挥着关... 【目的】呼吸爆发氧化酶(respiratory burst oxidase homolog protein,RBOH)是一种酶复合物,其催化作用受RBOHs关键合成基因的限制,同时与氧气消耗的突然增加、活性氧(ROS)积累关系密切,在调控植物的各种发育过程和应激反应中发挥着关键作用。构建盐胁迫下葡萄酵母核文库系统,以探索RBOH基因参与葡萄应对非生物胁迫等分子调控机制。【方法】以150 mmol·L-1NaCl溶液对6年生的巨峰葡萄进行浇盐处理,12 h后收集葡萄根、茎、叶和果实样品,采用Gateway技术构建酵母单杂交(yeast one-hybrid,Y1H)核文库系统;使用血细胞计数器计量文库酵母滴度。利用Y1H和高通量测序技术(next-generation sequencing,NGS)筛选互作蛋白。在氨基酸缺陷培养基中添加3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)对启动子进行自激活验证和浓度筛选。使用基因本体论注释(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库对筛选基因进行富集分析和注释。【结果】容量检测结果显示,该文库酵母滴度为1.4×10^(9)CFU·μg^(-1)(菌落形成单位),插入片段长度500~2000 bp,重组率为100%。成功分离出长度为1070 bp的VvRBOHA启动子序列,并通过在线工具预测该序列具有多个顺式作用响应元件结合位点,包括多种激素如脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、乙烯,盐胁迫响应元件,以及MYB和W-box结合位点;利用该启动子筛选出1516个候选互作靶蛋白,其中转录因子有278个,激酶相关蛋白达405个。随机克隆8个高通量测序读数较高的候选蛋白并进行酵母回转验证试验,结果显示所有蛋白质与VvRBOHA启动子存在相互作用,表明利用该文库进行酵母单杂交筛选候选蛋白效率较高。【结论】成功构建了具有大容量和合适插入片段的酵母杂交文库,并利用该文库进行酵母单杂交筛选候选蛋白效率较高,并成功鉴定出与VvRBOHA启动子存在相互作用的多个候选转录因子。以上研究成果为葡萄应对非生物胁迫的调控策略开辟了新思路。 展开更多
关键词 葡萄 CDNA文库 vvrboha 盐胁迫 酵母单杂交
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