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转运必需内体分选复合物螺旋纤丝Vps24⁃Vps2的冷冻电镜结构研究
1
作者 刘德生 李耀旺 孙珊 《电子显微学报》 北大核心 2025年第1期28-35,共8页
转运必需内体分选复合物-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ,ESCRT-Ⅲ)介导了一系列细胞膜重塑事件,包括多囊体的形成、细胞分裂和病毒释放等。这些过程的关键步骤之一是将ESCRT-Ⅲ蛋白亚基组装成纤丝状结构。在... 转运必需内体分选复合物-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ,ESCRT-Ⅲ)介导了一系列细胞膜重塑事件,包括多囊体的形成、细胞分裂和病毒释放等。这些过程的关键步骤之一是将ESCRT-Ⅲ蛋白亚基组装成纤丝状结构。在本研究中,作者利用冷冻电镜技术解析了由Vps24和Vps2融合蛋白(Vps24-Vps2)形成的双链螺旋纤丝的结构,分辨率为4.07A。在该结构中,呈伸展构象的Vps24-Vps2单体首先形成反向结合的二聚体,二聚体之间再错位结合形成一股螺旋,两股螺旋互相缠绕最终形成纤丝。该结构为理解ESCRT-Ⅲ丝状结构组装以及解聚过程提供了结构基础。 展开更多
关键词 转运必需内体分选复合物 ESCRT vps24 vps2 冷冻电镜结构
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猫源细小病毒上海株的分离鉴定及VP2基因遗传进化分析
2
作者 唐聪圣 刘健 +9 位作者 常晓静 夏炉明 张忠海 白艺兰 范玉凤 朱亭仪 桂亚萍 夏琦琦 王建 赵洪进 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第4期2071-2081,共11页
【目的】了解上海地区猫源细小病毒VP2基因遗传进化情况,丰富猫源细小病毒的流行病学,为其新型疫苗研究提供技术支持。【方法】对采自上海地区的14份疑似细小病毒感染的猫粪便拭子样品进行病毒分离,采用PCR扩增、间接免疫荧光试验(IFA)... 【目的】了解上海地区猫源细小病毒VP2基因遗传进化情况,丰富猫源细小病毒的流行病学,为其新型疫苗研究提供技术支持。【方法】对采自上海地区的14份疑似细小病毒感染的猫粪便拭子样品进行病毒分离,采用PCR扩增、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒粒子形态学观察等方法对分离株进行鉴定,并对分离株VP2基因进行测序和遗传进化分析,进一步对VP2蛋白进行生物信息学分析。【结果】从14份样品中分离到4株病毒,PCR扩增序列与犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)CH-AH-D5、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)cat-2、FPV HN1806和FPV BFPV-1株VP2基因部分序列相似性达100%,分别命名为CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a、FPV/SH/CHN/01/2022、FPV/SH/CHN/02/2022和FPV/SH/CHN/03/2022。其中1株鉴定为CPV New CPV-2a亚型,另外3株鉴定为FPV。相似性比对显示,CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a株与FPV疫苗株CU-4、Purevax核苷酸序列相似性分别为98.2%和98.3%;相比标准株,分离株14个关键氨基酸位点均未发生变化,但是相比FPV疫苗株,CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a株VP2蛋白中有12个关键氨基酸位点发生突变。遗传进化分析显示,CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a株属于CPV分支,与CPV中国株06/09、CPV-G15同属一个亚分支;3株FPV分离株均属FPV分支,但是处于不同亚分支。相比FPV疫苗株,CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a株的抗原决定簇存在2个氨基酸位点突变,分别位于第93(K-N)和300位(A-G)氨基酸处;相比CPV疫苗株,CPV/SH/CHN/01/2022/New CPV-2a株抗原决定簇存在1个氨基酸位点差异,位于第300位氨基酸处(A-G);3株FPV分离株与FPV疫苗株抗原决定簇7个位点均保持一致。【结论】本研究从上海地区分离获得4株猫源细小病毒,其中1株为CPV New CPV-2a亚型,3株为FPV。研究结果为CPV New CPV-2a亚型感染猫提供了佐证,丰富了猫源细小病毒的流行病学,也为其新型疫苗研究提供了参考资料。 展开更多
关键词 细小病毒 分离鉴定 VP2基因 遗传进化
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表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫的构建与鉴定
3
作者 刘跃辉 孙颖颖 +3 位作者 王浩迪 索静霞 宋铭忻 刘贤勇 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第2期1008-1016,共9页
传染性法氏囊病严重制约家禽养殖业经济发展。因此,研发安全且高效的传染性法氏囊病疫苗成为当下备受瞩目的关键课题。为探索柔嫩艾美耳球虫作为活载体表达及递送传染性法氏囊病毒抗原的可行性,本研究构建表达该病毒VP2蛋白的转基因柔... 传染性法氏囊病严重制约家禽养殖业经济发展。因此,研发安全且高效的传染性法氏囊病疫苗成为当下备受瞩目的关键课题。为探索柔嫩艾美耳球虫作为活载体表达及递送传染性法氏囊病毒抗原的可行性,本研究构建表达该病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫株(Et-VP2)。构建表达质粒,酶切后核转染入柔嫩艾美耳球虫中,利用流式细胞分选技术筛选得到表达红色荧光报告基因(mCherry)的阳性虫株,在基因和蛋白水平上鉴定VP2基因的表达。结果显示,构建表达VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫经雏鸡体内3次传代阳性球虫荧光率已高于95%,在球虫基因和蛋白水平上证实了外源基因的成功插入和稳定表达(后代群体荧光率均达95%),间接免疫荧光结果显示融合蛋白(Mic2-linker-VP2)定位于柔嫩艾美耳球虫子孢子顶端。本研究成功建立柔嫩艾美耳球虫稳定转染体系,为后续转基因虫株的传染性法氏囊病免疫保护研究奠定基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 传染性法氏囊病病毒 VP2 MCHERRY 转基因
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山东省部分地区水貂博卡病毒检测及遗传变异分析
4
作者 徐立志 于永乐 +1 位作者 刘刚 韩先杰 《中国动物检疫》 2026年第3期40-47,共8页
为了解山东省水貂博卡病毒(mink bocavirus,MBoV)的感染情况,2024年1—12月从山东省5个地区的10个规模化养貂场共采集850份腹泻水貂粪便样品,采用PCR方法检测MBoV,并对其NS1和VP2基因进行扩增与测序,利用MegAlign软件进行序列同源性分析... 为了解山东省水貂博卡病毒(mink bocavirus,MBoV)的感染情况,2024年1—12月从山东省5个地区的10个规模化养貂场共采集850份腹泻水貂粪便样品,采用PCR方法检测MBoV,并对其NS1和VP2基因进行扩增与测序,利用MegAlign软件进行序列同源性分析,然后基于MEGA 6.0软件构建系统发育进化树,分析病毒遗传进化特征。结果显示:在850份水貂粪便样品中,共检出MBoV阳性样品36份,阳性率为4.24%;从阳性样品中成功扩增出7条NS1与VP2基因序列;经序列分析,7条NS1和VP2序列间核苷酸一致性均为100%;系统发育进化树分析显示,扩增序列所在毒株均属于MBoV 1亚型,与参考毒株MBoV 1 VP2蛋白氨基酸序列相比,分离株出现6个突变位点,分别为K^(18)R、A^(20)S、D^(72)Y、W^(83)S、A^(342)R、E^(523)G。结果表明,山东省水貂群体中存在MBoV感染,与参考毒株相比,其VP2蛋白氨基酸序列有6个特征性突变位点,这可能会影响病毒毒力。本研究揭示了山东省MBoV感染与遗传变异情况,为该地区MBoV感染的监测预警、流行病学调查、防控策略制定等提供了数据支撑。 展开更多
关键词 水貂博卡病毒 流行病学 NS1基因 VP2基因 遗传变异
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基于单抗的A型塞内卡病毒抗体竞争化学发光酶联免疫检测方法的建立
5
作者 马震原 闫若潜 +6 位作者 柴茂 王淑娟 赵雪丽 杨海波 王东方 刘影 王翠 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第7期1402-1410,共9页
为了建立了一种快速定量检测A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法(chemiluminescent enzymee-linked immunoassay,CLEIA),在聚苯乙烯板中包被灭活SVA抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗SVA VP2、VP3... 为了建立了一种快速定量检测A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)抗体的竞争化学发光酶联免疫检测方法(chemiluminescent enzymee-linked immunoassay,CLEIA),在聚苯乙烯板中包被灭活SVA抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗SVA VP2、VP3蛋白单克隆抗体作为血清样本中抗体的竞争酶标抗体,以阳性血清稀释制备的校准品绘制标准曲线实现定量检测,成功建立的SVA竞争CLEIA在45 min内即可完成检测,可检测到最大稀释倍数为1∶2048的校准品溯源血清,与口蹄疫等其他5种病毒抗原的标准阳性血清无交叉反应;批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,重复性和稳定性较好;与中和试验分别检测480份临床血清,阳、阴性符合率分别为95.30%、97.57%,总符合率为96.88%,具有高度的一致性。结果表明,建立的SVA竞争CLEIA检测方法可以用于SVA抗体的快速定量检测。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 VP2 VP3 竞争化学发光酶联免疫 定量
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携带FPV VP2基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌口服疫苗免疫原性研究
6
作者 陈慧敏 王文婕 +7 位作者 韩新雨 贾钰航 余祖华 贾艳艳 廖成水 丁轲 尚珂 陈松彪 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第7期947-952,共6页
本试验旨在评价表达泛猫白细胞减少综合症病毒(FPV)VP2蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd口服疫苗的免疫原性。将重组菌按照10^(6)CFU/只的剂量口服免疫6周龄雌性KM小鼠,在免疫后第7、14、21、28、35和42天进行称重,检测VP2... 本试验旨在评价表达泛猫白细胞减少综合症病毒(FPV)VP2蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd口服疫苗的免疫原性。将重组菌按照10^(6)CFU/只的剂量口服免疫6周龄雌性KM小鼠,在免疫后第7、14、21、28、35和42天进行称重,检测VP2特异性Ig G抗体、中和抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化。同时口服免疫8周龄健康田园猫,检测疫苗的攻毒保护效果。结果显示,与对照组相比,重组菌免疫后对小鼠体重无明显影响(P>0.05);重组菌免疫小鼠后能够显著诱导血清中针对VP2特异性抗体和中和抗体水平(P<0.05);IL-4和IFN-γ细胞因子水平显著升高(P<0.05),且在免疫后第28天达到峰值;重组菌免疫猫后对FPV感染具有一定程度的免疫保护效果,可明显降低实验猫致死率并且延缓发病时间和发病程度。以上结果表明,构建的FPV VP2重组减毒鼠伤寒沙门菌口服疫苗能够有效刺激机体产生免疫应答且具有较好的免疫保护效力,为进一步研发FPV新型疫苗奠定了良好基础。 展开更多
关键词 泛猫白细胞减少综合症病毒 VP2 SL1344ΔcrpΔasd 口服疫苗 免疫原性
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犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
7
作者 龚婷 马辉 郑鸣 《家畜生态学报》 北大核心 2025年第7期81-84,118,共5页
为获得犬细小病毒(canine parvovirus disease,CPV)VP2蛋白单克隆抗体,该研究利用原核表达技术对VP2蛋白进行截短表达,制备单克隆抗体。结果显示:获得了3株稳定的单克隆抗体(C6F7、D2E4、E3F6),其抗体效价分别为1∶1024000、1∶1024000... 为获得犬细小病毒(canine parvovirus disease,CPV)VP2蛋白单克隆抗体,该研究利用原核表达技术对VP2蛋白进行截短表达,制备单克隆抗体。结果显示:获得了3株稳定的单克隆抗体(C6F7、D2E4、E3F6),其抗体效价分别为1∶1024000、1∶1024000、1∶2048000,染色体数目分别为106、105、103,重链分别为IgG1、IgG2b和IgG1,轻链均为κ链,均能与VP2蛋白和CPV感染的F81细胞发生特异性反应,均与4种常见病毒不发生交叉反应。该研究获得了3株抗体效价高、特异性强、免疫学活性好的VP2蛋白单克隆抗体,可为CPV基础性研究和免疫学诊断试剂盒开发奠定基础。 展开更多
关键词 犬细小病毒 VP2蛋白 单克隆抗体 制备与鉴定
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共表达IBDV VP2蛋白和AIV HA蛋白的重组NDV的构建 被引量：2
8
作者 王晓晓 司凯新 +7 位作者 尚珂 陈松彪 余祖华 丁轲 陈建 李日顺 郁川 何雷 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第6期748-756,共9页
为构建共表达新变异型传染性法氏囊病毒(nVarIBDV)VP2蛋白和H9亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白的耐热型重组NDV,将nVarIBDV VP2基因和AIV HA基因经2A肽连接后插入重组质粒pNDV-Ⅶ-F中;然后,重组质粒与辅助质粒pTM-N/P/L共转染BHK-21细胞,拯... 为构建共表达新变异型传染性法氏囊病毒(nVarIBDV)VP2蛋白和H9亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白的耐热型重组NDV,将nVarIBDV VP2基因和AIV HA基因经2A肽连接后插入重组质粒pNDV-Ⅶ-F中;然后,重组质粒与辅助质粒pTM-N/P/L共转染BHK-21细胞,拯救出共表达VP2蛋白和HA蛋白的重组病毒r NDV-Ⅶ-F-VP2-HA和r NDV-Ⅶ-F-HA-VP2并鉴定。RT-PCR鉴定表明目的基因成功插入至重组NDV的P、M基因之间;IFA检测结果表明,重组病毒r NDV-Ⅶ-F-HA-VP2感染细胞可稳定表达VP2蛋白和HA蛋白,而重组病毒r NDV-Ⅶ-F-VP2-HA感染细胞后仅检测到VP2蛋白表达。生物学特性检测表明2株重组病毒均具有亲本毒株的高增殖效价、低毒力和良好耐热性特点。综上所述,本研究成功地构建了共表达nVarIBDV VP2蛋白和H9N2 AIV HA蛋白的重组病毒r NDV-Ⅶ-F-VP2-HA和r NDV-Ⅶ-F-HA-VP2,为n VarIBDV、H9N2 AIV及基因Ⅶ型NDV的综合防控提供了一种新的策略。 展开更多
关键词 新城疫病毒 传染性法氏囊病毒 VP2蛋白 禽流感病毒 HA蛋白
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口蹄疫病毒通用型结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
9
作者 张慧艳 李坤 +6 位作者 孙梦阳 邢向川 付元芳 李平花 李冬 卢曾军 曹轶梅 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第8期1011-1017,共7页
为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法,本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原,经过条件优化,建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法,并分析了该方法的... 为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、Asia 1型通用结构蛋白抗体检测方法,本研究用FMDV各血清型间高度保守的结构蛋白VP2氨基端短肽为抗原,经过条件优化,建立了可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体的间接ELISA方法,并分析了该方法的敏感性、特异性、重复性以及与液相阻断ELISA(LPB-ELISA)的符合性。结果显示,该短肽最佳包被浓度为2μg/m L,最适封闭液为1%BSA+5%蔗糖,血清最佳稀释度为1∶4,酶标二抗稀释比例为1∶5000。以约登指数最大作为临界值,测定其敏感性为87.5%,特异性为93%,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清均未出现交叉反应,且批间与批内变异系数均≤10%。与LPB-ELISA的符合率为92.59%。该方法耗时短、操作简捷,可检测牛血清中FMDV不同血清型结构蛋白抗体,为FMDV感染的诊断和群体免疫状况的评估提供了一种通用方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 结构蛋白VP2 通用型 间接ELISA
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鸡传染性贫血病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立 被引量：2
10
作者 王冷眉 万培伟 +3 位作者 韩旭 易松强 闫莹莹 林翠 《中国家禽》 北大核心 2025年第3期78-84,共7页
为建立一种简便、快速的鸡传染性贫血病毒(CIAV)检测方法,试验针对CIAV VP2基因序列设计了多组引物和探针,经过引物筛选及反应温度和时间的优化,建立了CIAV的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(RPA),并对该方法的特异性、敏感性及重复性进... 为建立一种简便、快速的鸡传染性贫血病毒(CIAV)检测方法,试验针对CIAV VP2基因序列设计了多组引物和探针,经过引物筛选及反应温度和时间的优化,建立了CIAV的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(RPA),并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评估,应用该方法与荧光定量PCR(q PCR)同时对50份临床样品进行检测,比较两种方法的符合率。结果显示:该方法可在39℃恒温条件下20 min内快速、准确地检出CIAV,与其他6种常见的禽类病原体如传染性法氏囊病病毒(IBDV)、马立克病病毒(MDV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、新城疫病毒(NDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)不存在交叉反应;该方法对质粒DNA的检测限为1×10~2 copies/μL;该方法检测50份临床样品中有9份阳性,与q PCR的检测结果一致。研究表明:建立的检测CIAV的RPA操作简单、反应灵敏、特异性高、检测结果可靠,可用于鸡传染性贫血的快速检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 VP2基因 重组酶聚合酶等温扩增技术 快速检测
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脑心肌炎病毒VP22A基因真核表达载体的构建 被引量：2
11
作者 邵帅 纪晓岚 +1 位作者 刘明启 李琼毅 《中国动物保健》 2025年第1期240-241,共2页
为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至... 为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 VP2基因 2A基因 真核表达载体
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大西洋鲑传染性胰腺坏死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重组腺病毒载体的构建及其表达 被引量：1
12
作者 李守湖 秦闯 +1 位作者 李新苍 石建高 《水产科技情报》 2025年第1期26-32,共7页
传染性胰腺坏死病(infectious pancreatic necrosis,IPN)是由传染性胰腺坏死病病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)引起的一种主要危害鲑科鱼类的传染病。为克隆传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)VP2基因和VP3基因,并构建其重组... 传染性胰腺坏死病(infectious pancreatic necrosis,IPN)是由传染性胰腺坏死病病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)引起的一种主要危害鲑科鱼类的传染病。为克隆传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)VP2基因和VP3基因,并构建其重组腺病毒载体,利用PCR方法分别扩增出IPNV VP2基因和VP3基因,通过多基因片段同源重组技术将IPNV VP2基因和VP3基因克隆到pAd-Track-CMV载体,经过线性化后与pAd-easy-1载体在BJ5183菌体内进行同源重组,构建出重组腺病毒质粒;通过PCR及NotⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,再经PacⅠ线性化后用于转染293T细胞,获得重组腺病毒;通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达监控重组腺病毒的复制情况,用Western-blotting法分别检测IPNV VP2蛋白和VP3蛋白的表达,并测定重组病毒滴度。结果显示,分别克隆出IPNV VP2和VP3基因,基因总长度为2211 bp,构建出目的基因重组腺病毒载体,该病毒在293T细胞中分别表达出蛋白分子质量约为54 kD和26 kD的产物,滴度为1.0×10^(9)个/mL TCID_(50)。结果表明,已成功获得IPNV VP2基因和VP3基因重组腺病毒,该病毒在293T细胞中滴度较高,能够稳定表达。传染性胰腺坏死病病毒VP2蛋白和VP3蛋白重组腺病毒载体的成功构建可为大西洋鲑传染性胰腺坏死病活载体疫苗的研制提供参考。 展开更多
关键词 大西洋鲑 传染性胰腺坏死病 VP2基因 VP3基因 腺病毒载体
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牛细小病毒2型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用
13
作者 杨澳飞 刘飞飞 +10 位作者 陈慧敏 余祖华 韩新雨 贾东鹭 贾钰航 陈建 魏颖 何雷 马雪连 陈松彪 丁轲 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第3期362-368,共7页
本试验旨在建立一种牛细小病毒2型(bovine parvovirus,BPV-2)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。首先参考数据库中不同BPV-2序列,设计VP2基因保守区域特异性引物,优化反应体系,初步建立一种BPV-2特异性SYBRGreenⅠ荧光定量PCR(qPCR)... 本试验旨在建立一种牛细小病毒2型(bovine parvovirus,BPV-2)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。首先参考数据库中不同BPV-2序列,设计VP2基因保守区域特异性引物,优化反应体系,初步建立一种BPV-2特异性SYBRGreenⅠ荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,扩增VP2基因片段长度约156 bp,符合目的基因片段大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的最低检测限为3.32×10^(1)copies/μL,而常规PCR方法检测限为3.32×10^(3)copies/μL,表明本研究方法敏感性较高。用该方法检测牛细小病毒Ⅰ型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛疱疹病毒I型时结果均为阴性,表明本方法特异性强。重复性试验结果表明,组内和组间重复变异率均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。分别采用本研究所建立的方法和文献中发表的方法对80份腹泻牛粪便进行检测比较。结果显示,两种方法的阳性检出率均为11%(9/80),总符合率达100%。以上结果表明本研究建立基于BPV-2 VP2基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好特异性、灵敏性、重复性,为BPV-2的临床流行病学调查及快速检测提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 牛细小病毒2型 VP2基因 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 建立 应用
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猪细小病毒2型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
14
作者 帅文娜 李佳乐 +8 位作者 郭子强 罗梦 李丽薇 周艳君 姜一峰 童武 童光志 李兆龙 高飞 《畜牧与兽医》 北大核心 2025年第8期78-84,共7页
旨在制备猪细小病毒(PPV)VP2的多克隆抗体,并进行其检测能力验证。将PPV VP2克隆至原核表达载体pCold-TF,由1 mmol/L IPTG诱导得到VP2蛋白;纯化后VP2蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blot、间接免疫荧光试验(I... 旨在制备猪细小病毒(PPV)VP2的多克隆抗体,并进行其检测能力验证。将PPV VP2克隆至原核表达载体pCold-TF,由1 mmol/L IPTG诱导得到VP2蛋白;纯化后VP2蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blot、间接免疫荧光试验(IFA)验证其反应性。ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价达1∶128000;Western blot和IFA分析表明,其能特异性识别和结合PPV,说明重组VP2蛋白具有较好的免疫原性和反应原性。本研究为VP2血清学检测方法的建立及其蛋白的功能研究提供了材料。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白 多克隆抗体 原核表达
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大口黑鲈双RNA病毒VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备
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作者 张秋爽 马宝福 +6 位作者 郑果 林强 梁红茹 牛银杰 罗霞 李宁求 付小哲 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第7期18-25,共8页
【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重... 【目的】研究大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus,LBBV)VP2蛋白的抗原性,为后续LBBV疫苗研究提供基础材料。【方法】PCR扩增LBBV VP2基因,构建重组质粒pET-VP2,PCR和测序鉴定后转入大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。以纯化的重组VP2蛋白为抗原,皮下多点注射免疫新西兰大白兔,耳中央动脉采血并分离血清,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;利用Ni-NTA镍离子亲和层析纯化抗体,用BCA法测定纯化后抗体的浓度。通过Western blot和间接免疫荧光鉴定VP2多克隆抗体特异性;采用固定病毒-稀释血清法测定血清的中和效价。【结果】PCR扩增获得了1266 bp的VP2基因片段。PCR和测序鉴定结果表明,重组质粒pET-VP2构建成功。VP2重组蛋白的诱导表达和纯化试验结果获得了64 ku的重组蛋白,符合预期大小。成功制备了VP2蛋白的多克隆抗体,其质量浓度为10 mg/mL,效价为1∶1024000,可特异性识别LBBV VP2蛋白;血清中和试验结果显示,VP2多抗中和抗体效价为1∶64。【结论】成功获得了大肠杆菌表达的LBBV重组VP2蛋白,制备了抗VP2蛋白的多克隆抗体,该多抗对LBBV具有中和作用。 展开更多
关键词 大口黑鲈 大口黑鲈双RNA病毒 VP2蛋白 多克隆抗体
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A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体制备与竞争ELISA方法的建立
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作者 何启杰 农作荣 +7 位作者 王豪 牛晨霞 莫勇芳 欧阳康 陈樱 黄伟坚 黄稳妃 韦祖樟 《动物医学进展》 北大核心 2025年第2期23-29,共7页
依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其... 依据A型塞内卡病毒(SVA)结构蛋白VP2基因序列构建原核表达质粒pET-30a-VP2,经转化和诱导,表达出VP2重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,采集血清获得VP2的多克隆抗体。用间接ELISA方法测定血清中VP2抗体效价,并用Western blot与IFA验证其特异性。随后建立竞争ELISA方法,并对实验室收集的2016-2019年广西11个地区64个规模猪场592份猪血清进行SVA抗体检测。结果显示,诱导表达出的重组VP2蛋白主要以可溶性形式表达,血清中VP2抗体效价大于1∶64000,且制备的VP2抗体能特异结合SVA感染细胞中的VP2蛋白。竞争ELISA检测结果显示广西地区猪场SVA血清阳性率高达76.6%,血清样品阳性率高达55.9%,研究结果为SVA的检测和研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡 VP2蛋白 原核表达 多克隆抗体 竞争ELISA
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猪细小病毒TaqMan实时定量荧光PCR方法的建立与应用
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作者 唐银保 李丽薇 +8 位作者 周艳君 郭子强 刘佳晨 王树茂 王安冉 李佳乐 杨倩 李兆龙 高飞 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第6期99-106,共8页
猪细小病毒(PPV)是引起母猪生殖障碍的主要病原体之一。本研究针对PPV VP2基因的保守序列设计一种新型的TaqMan探针,创建一种检测PPV的快速而准确的实时荧光定量PCR方法。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品质粒在1×10^(10)~1×... 猪细小病毒(PPV)是引起母猪生殖障碍的主要病原体之一。本研究针对PPV VP2基因的保守序列设计一种新型的TaqMan探针,创建一种检测PPV的快速而准确的实时荧光定量PCR方法。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品质粒在1×10^(10)~1×10^(2) copies/μL范围内具有良好的线性关系,其回归方程为y=-3.4162x+39.28,相关系数R^(2)=0.99,斜率为-3.4162,检测拷贝数下限为1×10^(1) copies/μL,组内与组间变异系数均小于0.9864%。该方法灵敏度高,重复性良好,并且该方法在实际临床样品检测中可行,可用于猪细小病毒病的诊断。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白 TaqMan实时定量荧光PCR
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辽宁省沈阳市猫泛白细胞减少症病毒VP2、NS1基因的遗传进化分析
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作者 刘琪 刘正伟 +6 位作者 张利 王超 郝春晖 高锋 姜仁礼 梁琳 田长永 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期81-87,共7页
为了解辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)VP2和NS1基因的遗传变异情况,试验从辽宁省沈阳市3个动物医院和1个猫繁育场收集疑似FPV感染的猫粪便拭子样本13份(编号为FPV-8~FPV-20),利用胶体金试纸条进行FP... 为了解辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)VP2和NS1基因的遗传变异情况,试验从辽宁省沈阳市3个动物医院和1个猫繁育场收集疑似FPV感染的猫粪便拭子样本13份(编号为FPV-8~FPV-20),利用胶体金试纸条进行FPV检测,提取阳性样本中的病毒DNA后进行VP2和NS1基因的PCR扩增、测序、同源性分析、编码蛋白的氨基酸突变位点分析及遗传进化树构建。结果表明:13份样本均呈FPV阳性,经PCR扩增均得到大小为1755 bp的VP2基因和大小为2007 bp的NS1基因。13份样本中的FPV VP2基因之间的核苷酸相似性为98.7%~100%,与GenBank中FPV参考毒株的核苷酸相似性为98.6%~100%,其中FPV-LN15、FPV-LN18、FPV-LN19与BJ540(MT270553.1)、FPV ZJFPV15(MW495840.1)和FPV-SH2003(MW811187.1)的核苷酸相似性为100%;13份样本中的FPV NS1基因之间的核苷酸相似性为99.0~100%,与GenBank中FPV参考毒株的核苷酸相似性为99.1%~99.9%,其中FPV-LN8、FPV-LN10和PPV-LN13的核苷酸相似性为100%,FPV-LN9、FPV-LN18和FPV-LN19的核苷酸相似性为100%,PPV-LN15和FPV-LN17的核苷酸相似性为100%。13份样本中的FPV VP2蛋白共存在5个氨基酸突变位点(第91,301,302,305,307位),FPV NS1蛋白共存在6个氨基酸突变位点(第17,23,60,247,443,596位)。基于VP2基因构建的遗传进化树中共分为2个大分支,FPV和水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)毒株聚为一支,犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)毒株处于一个独立分支。样本FPV-LN11、FPV-LN13、FPV-LN8、FPV-LN16、FPV-LN10、FPV-LN20处于一个较小分支,样本FPV-LN14处于独立小分支,且与FPV HNZZ2株(MZ005633.1,郑州)、FPV Barut株(MZ391096.1,土耳其)、FPV 17D01株(OP153925.1,韩国)、FPV DLC02株(MN418998.1,大连)处于不同小分支;样本FPV-LN9、FPV-LN12、FPV-LN15、FPV-LN18、FPV-LN19与FPV JSNJ-21G5株(OP796709.1,扬州)、FPV BJ540株(MT270553.1,北京)、FPV-SH2003株(MW811187.1,上海)、FPV ZJFPV15株(MW495840.1,扬州)处于一个较小分支,样本FPV-LN17处于独立小分支,且与FPV_ARG08(FJ440714.1)株(阿根廷)处于不同小分支。基于NS1基因构建的遗传进化树共分为两个大分支,FPV毒株和CPV毒株分别为两个独立的分支,FPV-LN9、FPV-LN12、FPV-LN15、FPV-LN17、FPV-LN14、FPV-LN18、FPV-LN19与FPV-SH2003株(MW811187.1,上海)和FPV-SH2001株(MW650831.1,上海)处于一个较小分支,FPV-LN8、FPV-LN11、FPV-LN13、FPV-LN10、FPV-LN16、FPV-LN20株与FPV HNZZ2株(MZ005633.1,郑州)处于一个较小分支,均与FPV_IZSSI_42807_15株(KX434462.1,意大利)、FPV株(X55115.1,澳大利亚)处于不同小分支。说明各样本两种基因的亲缘关系基本一致(除样本FPV-LN14外),FPV毒株在同一地理范围内具有较高的遗传相似性。 展开更多
关键词 猫泛白细胞减少症病毒 VP2基因 NS1基因 基因突变 遗传进化分析
原文传递
A型塞内卡病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条的制备及初步应用
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作者 李帅鹏 石正旺 +9 位作者 陈婕 罗俊聪 朱昱茜 石鑫泰 席韬 张帆 何印娣 郑海学 张小丽 田宏 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第8期4086-4094,共9页
本研究拟建立一种快速、准确、简便的A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)抗体胶体金检测方法,用于SVA的感染诊断。通过原核系统表达纯化获得SVA VP2重组蛋白,并制备VP2蛋白多克隆抗体;将VP2蛋白与胶体金偶联形成金标抗原。随后,将VP2蛋白... 本研究拟建立一种快速、准确、简便的A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)抗体胶体金检测方法,用于SVA的感染诊断。通过原核系统表达纯化获得SVA VP2重组蛋白,并制备VP2蛋白多克隆抗体;将VP2蛋白与胶体金偶联形成金标抗原。随后,将VP2蛋白和VP2多克隆抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线(T线)和质控线(C线),优化反应体系制备试纸条。结果表明,制备的试纸条检测口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒A型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒阳性血清及健康猪(SPF)血清时,均无交叉反应,特异性良好;对SVA阳性血清的检测灵敏度达1∶64,通过对150份猪临床血清样品进行试纸条和病毒中和试验的平行检测,两者的Kappa值为0.88,表明两种方法高度一致。综上所述,本研究成功开发了SVA抗体检测试纸条,可在10~15 min内完成检测,具有快速、准确、简便等优点,为临床定性检测及现场快速诊断塞内卡病毒病提供了有效工具。 展开更多
关键词 塞内卡病毒抗体 VP2蛋白 胶体金免疫层析试纸条
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表达IBDV VP2-C3d融合蛋白的转基因堆型艾美耳球虫的构建及其卵囊排出规律的研究
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作者 王浩迪 刘跃辉 +4 位作者 郭庆彬 孙颖颖 刘贤勇 宋铭忻 索勋 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第12期1223-1228,1236,共7页
为构建表达IBDV VP2-C3d融合蛋白的转基因堆型艾美耳球虫Ea-VP2-C3d株,探究其卵囊排出规律。本研究以pEa-VP2质粒为模板,通过PCR分别扩增MIC2启动子、VP2基因、Flag标签、载体骨架片段和优化的鸡补体C3d基因片段(由公司合成),利用同源... 为构建表达IBDV VP2-C3d融合蛋白的转基因堆型艾美耳球虫Ea-VP2-C3d株,探究其卵囊排出规律。本研究以pEa-VP2质粒为模板,通过PCR分别扩增MIC2启动子、VP2基因、Flag标签、载体骨架片段和优化的鸡补体C3d基因片段(由公司合成),利用同源重组技术构建重组质粒pEa-VP2-C3d。将酶切线性化质粒转染野生型堆型艾美耳球虫北京株(Ea-WT)子孢子,接种雏鸡后收集粪便卵囊,利用流式细胞术(FACS)筛选红色荧光(mCherry)阳性卵囊并传代,连续传至第4代(P4)。采用PCR、Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测P4代重组虫株中VP2-C3d基因的转录与蛋白表达。将7日龄雏鸡随机分为Ea-WT组、Ea-VP2组和Ea-VP2-C3d组(n=4),将各组雏鸡分别接种对应虫株卵囊(2×10^(4)个/只),动态监测初次感染(4 d~14 d)和二次感染(初次感染后15 d)(5×10^(5)个/只,感染后5 d~7 d)鸡的排卵囊量。结果显示,正确构建pEa-VP2-C3d质粒;FACS筛选后P1代荧光卵囊的阳性率为0.7%,P2代升至33%,P3和P4代荧光卵囊的阳性率均>90%且稳定,表明获得遗传稳定的Ea-VP2-C3d株;PCR、Western blot均检测到预期大小的特异性条带,IFA显示融合蛋白表达于子孢子的胞质中;转基因株感染鸡的排卵囊规律与野生型相似,接种后4 d开始排卵囊,6 d后达到高峰,但总排卵囊量极显著低于野生型降低(P<0.001),孢子化率>90%。本研究构建能够稳定表达IBDV VP2-C3d融合蛋白的转基因堆型艾美耳球虫Ea-VP2-C3d株,为开发预防传染性法氏囊与球虫感染的基因工程疫苗提供基础数据。 展开更多
关键词 球虫活载体疫苗 VP2蛋白 C3d分子佐剂 传染性法氏囊病病毒
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