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余甘子果实斑点病菌LAMP可视化检测方法的建立 被引量：1
1
作者 赖多 王德林 +3 位作者 邵雪花 秦健 庄庆礼 肖维强 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期69-79,90,共12页
【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌(Diaporthe ph... 【目的】建立余甘子果实斑点病菌快速、便捷、灵敏、可视的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,为该病害的风险预判和科学防治提供依据。【方法】以余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌(Diaporthe phoenicicola)的翻译延伸因子EF-1α基因为靶序列,设计LAMP特异性扩增引物;以余甘子间座壳菌DNA为模板,优化反应温度、反应时间、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度和内外侧引物浓度比,建立LAMP检测最佳反应体系,测试其特异性和灵敏性,并对余甘子发病果实进行实际检测。【结果】适用于余甘子果实斑点病LAMP检测的最佳引物为引物组合4(EF4-F3/EF4-B3和EF4-FIP/EF4-BIP);LAMP检测最佳反应条件为dNTPs浓度1.0 mmol/L,Mg^(2+)浓度4 mmol/L,内外侧引物质量比6∶1,反应温度63℃,反应时间50 min。优化后的LAMP检测方法可特异性地检出余甘子间座壳菌(D.phoenicicola),检测灵敏度可达0.01 ng/μL,且在实际应用中准确率高达100%。【结论】首次建立了余甘子果实斑点病致病菌间座壳菌LAMP可视化快速检测方法,该方法特异性强、灵敏度高,操作简单,可用于田间余甘子果实斑点病菌的快速检测。 展开更多
关键词 余甘子 间座壳菌 环介导等温扩增技术 灵敏性 特异性 可视化
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水禽细小病毒LAMP及其可视化通用检测方法的建立
2
作者 戴银 周慧琴 +9 位作者 谷思琴 胡晓苗 王洁茹 殷冬冬 尹磊 沈学怀 潘孝成 赵瑞宏 周学利 侯宏艳 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第7期63-68,共6页
为了建立鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)通用的检测方法,本试验以GPV和MDPV两种水禽细小病毒的NS基因保守序列作为靶标,设计了1组特异性引物,优化建立了水禽细小病毒的环介导等温扩增(LAMP)和LAMP-羟基萘酚蓝(HNB)可视化通用检测... 为了建立鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)通用的检测方法,本试验以GPV和MDPV两种水禽细小病毒的NS基因保守序列作为靶标,设计了1组特异性引物,优化建立了水禽细小病毒的环介导等温扩增(LAMP)和LAMP-羟基萘酚蓝(HNB)可视化通用检测方法,并对2种方法的特异性和灵敏性进行检测。采用常规PCR、LAMP和LAMP-HNB对10份水禽临床样品进行检测,以评估2种方法的实用性。结果显示,LAMP方法的最佳反应温度为65℃、反应时间为60 min。2种方法仅能扩增GPV和MDPV,而对其他5种常见水禽病毒的检测结果均为阴性,最低检出浓度均为1×10-5ng/μL。2种方法与常规PCR的检测结果一致,符合率达100%。结果表明,建立的LAMP方法和LAMP-HNB可视化方法具有灵敏性好、特异性高、仪器要求低和可视化等优点,可为水禽细小病毒的现场快速检测提供技术支撑。 展开更多
关键词 鹅细小病毒(GPV) 番鸭细小病毒(MDPV) NS基因 环介导等温扩增(lamp) 可视化
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梅花鹿茸和马鹿茸可视化LAMP检测方法的建立与应用
3
作者 张红 张珈晨 +3 位作者 徐佶婧 王洪阳 朱文赫 李亚巍 《食品研究与开发》 2025年第16期175-180,共6页
为建立一种高效、准确、灵敏的鹿茸检测方法,该研究分别针对梅花鹿茸和马鹿茸的线粒体基因序列设计3组不同的环介导等温扩增(loop‐mediated isothermal amplification,LAMP)引物,对其进行扩增并连接至载体pUC57,构建重组质粒,建立LAMP... 为建立一种高效、准确、灵敏的鹿茸检测方法,该研究分别针对梅花鹿茸和马鹿茸的线粒体基因序列设计3组不同的环介导等温扩增(loop‐mediated isothermal amplification,LAMP)引物,对其进行扩增并连接至载体pUC57,构建重组质粒,建立LAMP检测体系。通过对比不同引物的扩增效果,设置61~65℃温度梯度,优化检测梅花鹿茸和马鹿茸的条件。对比普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与LAMP检测方法的敏感性和特异性,筛选最优检测条件用于市售鹿茸样品的检测。结果显示,试验成功建立了梅花鹿茸和马鹿茸的LAMP试验反应体系,确定61℃孵育40 min是直接观察测定结果的最佳反应条件。敏感性试验显示,梅花鹿茸LAMP检测方法的敏感性为2 copies/μL,马鹿茸LAMP检测方法的敏感性为10 copies/μL,均远高于普通PCR试验结果。特异性试验结果显示,LAMP体系能区分梅花鹿茸和马鹿茸,可用于市售商品的检测。 展开更多
关键词 环介导等温扩增 马鹿 梅花鹿 可视化检测 鹿茸
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哈维氏弧菌LAMP可视化检测方法的建立
4
作者 于劼豪 黄郁葱 +4 位作者 孙良娟 钟键 鲁义善 简纪常 蔡双虎 《海洋渔业》 北大核心 2025年第1期29-39,共11页
为提高哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)早期快速诊断水平,建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术的可视化快速检测方法。利用表达环二聚体磷酸二酯的VieA基因序列在哈维氏弧菌中的保守性,将其作为靶基因设计引物,并初步建立LAMP反应体系,对L... 为提高哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)早期快速诊断水平,建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术的可视化快速检测方法。利用表达环二聚体磷酸二酯的VieA基因序列在哈维氏弧菌中的保守性,将其作为靶基因设计引物,并初步建立LAMP反应体系,对LAMP反应体系中各反应物浓度、内外引物比例、反应时间和反应温度进行优化,并对优化后的LAMP反应的特异性和灵敏度进行检测;分别在优化后的LAMP反应体系中加入SYBR Green I、钙黄绿素-锰离子或羟基萘酚蓝作为指标剂对LAMP反应产物进行可视化判别,从而建立一种针对哈维氏弧菌的LAMP可视化检测方法。研究表明,该LAMP反应体系最佳反应温度60℃、反应时间60 min、Mg2+浓度1.2 mmol·L^(-1)、dNTPs浓度0.64 mmol·L^(-1)、甜菜碱浓度0.25 mmol·L^(-1)及内外引物比例16∶1;该反应体系能特异性检测到哈维氏弧菌,且灵敏度为3.4×10-6 ng·μL^(-1)。可视化指标剂钙黄绿素-锰离子的添加比例为12∶1或羟基萘酚蓝的添加浓度为390μmol·L^(-1)时,LAMP反应产物的可视化效果最好,临床应用表明,该LAMP可视化技术能准确并特异性地检测到珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织中感染的哈维氏弧菌。研究提供了一种简单、快速和结果可视化的哈维氏弧菌LAMP检测方法,可以为水生动物哈维氏弧菌的现场检测和弧菌病的早期诊断提供技术支持。 展开更多
关键词 哈维氏弧菌 lamp技术 可视化检测 临床应用
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羊源产气荚膜梭菌LAMP检测方法的建立
5
作者 樊月圆 王瑾艺 +4 位作者 刘亚波 茶金龙 白卫兵 四朗玉珍 富国文 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第1期48-55,共8页
本研究旨在基于环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种快速诊断羊源产气荚膜梭菌的可视化快速检测方法。首先以产气荚膜梭菌cpa基因为靶基因,构建重组质粒;建立LAMP检测技术并对各反应条件进行优化,随后开展敏感性、特异性、重复性试验,扩... 本研究旨在基于环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种快速诊断羊源产气荚膜梭菌的可视化快速检测方法。首先以产气荚膜梭菌cpa基因为靶基因,构建重组质粒;建立LAMP检测技术并对各反应条件进行优化,随后开展敏感性、特异性、重复性试验,扩增产物可视化及临床样品检测。结果显示,本研究成功建立了羊源产气荚膜梭菌的LAMP检测方法,筛选出最适温度、Mg^(2+)浓度、Bst DNA聚合酶和dNTPs添加量以及内外引物最佳浓度比。并通过浊度法或添加HNB、SYBR GreenⅠ、钙黄绿素染料显色,实现可视化。使用该方法对6种常见肠道菌进行检测,仅对产气荚膜梭菌具有良好的特异性;以DNA为模板时,其灵敏度与荧光定量PCR法相近,是普通PCR的100倍;以菌液为模板时,其灵敏度比普通PCR法高出1~2个数量级,兼具便捷快速的特点。结果表明,本研究成功建立了羊源产气荚膜梭菌LAMP法,该方法可用于临床样品的快速检测。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 环介导等温扩增技术 可视化检测
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鸡星状病毒和禽肾炎病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立
6
作者 赵俊柯 余丹 +5 位作者 尹文巧 张艳芳 谢志勤 范晴 喻华英 谢芝勋 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第2期204-211,218,共9页
为建立一种能鉴别鸡星状病毒(chicken astrovirus, CAstV)和禽肾炎病毒(avian nephritis virus, ANV)的二重荧光RT-LAMP,该研究对比GenBank中下载的CAstV ORF1b基因和ANV ORF1b基因保守序列,分别设计了2套特异性引物和标记荧光基团的探... 为建立一种能鉴别鸡星状病毒(chicken astrovirus, CAstV)和禽肾炎病毒(avian nephritis virus, ANV)的二重荧光RT-LAMP,该研究对比GenBank中下载的CAstV ORF1b基因和ANV ORF1b基因保守序列,分别设计了2套特异性引物和标记荧光基团的探针。在CAstV探针3′端标记FAM荧光基团,5′端标记淬灭基团BHQ1;ANV探针3′端标记CY3荧光基团,5′端标记淬灭基团BHQ2,通过试验筛选出最适引物和探针浓度并进行反应条件的优化。用建立的二重荧光RT-LAMP进行特异性、敏感性、重复性和干扰性试验,并对采集自广西南宁不同地区的临床样品共300份进行检测,结果与RT-qPCR和RT-PCR比较,验证该方法的有效性。试验结果显示:建立的二重荧光RT-LAMP方法60 min即可反应结束,最适反应温度为65℃;设计的引物仅能检测CAstV和ANV,而对其他病源无交叉反应;CAstV最低检测限度为1.4×10^(2) copies/μL,ANV最低检测限度为1.5×10^(2) copies/μL,且干扰性试验和重复性试验良好;检测结果与RT-qPCR相比,CAstV和ANV检测结果符合率分别为97.97%和98.85%。综上所述,该研究建立的二重荧光RT-LAMP方法具有快速、准确、特异性好、灵敏性高、重复性好等特点,适用于临床诊断,为CAstV和ANV的流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 鸡星状病毒 禽肾炎病毒 可视化 RT-lamp 鉴别诊断
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B亚型禽偏肺病毒可视化荧光RT-LAMP方法的建立
7
作者 赵俊柯 谢芝勋 +7 位作者 余丹 张艳芳 谢志勤 范晴 尹文巧 杨冰怡 黄青红 喻华英 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期92-98,共7页
为了能快速鉴别B亚型禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus B,aMPVB)与其他禽类常见病毒,试验基于aMPVB F基因的保守区域设计一套特异性环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplilication,LAMP)引物,包括外引物F3和B3,内引物FIP(F1c+... 为了能快速鉴别B亚型禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus B,aMPVB)与其他禽类常见病毒,试验基于aMPVB F基因的保守区域设计一套特异性环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplilication,LAMP)引物,包括外引物F3和B3,内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2),环引物Floop和Bloop,其中FIP的5′端用淬灭基团BHQ2标记,同时在F3、B3之间引入1条探针FD,其3′端用CY5荧光基团标记,建立可视化荧光RT-LAMP方法,对该方法进行反应条件优化及特异性、敏感性检测,并利用该方法对临床样品进行检测。结果表明:建立的可视化荧光RTLAMP方法的最佳探针复合物浓度为0.32μmol/L,最佳反应温度为63℃;该方法仅能检测到aMPVB,其他17种禽类常见病毒均呈阴性;对aMPVB的最低检出限为1.2×10^(2)copies/μL,敏感性是普通PCR方法(1.2×10^(3)copies/μL)的10倍。该方法的反应时间为60 min,约为普通PCR方法的一半,大大提高了检测效率。利用该方法对采自广西地区的23份临床样本进行检测,结果与普通PCR方法完全一致。说明该方法能够快速、准确地检测aMPVB,特异性好,敏感性高,具有良好的实际应用价值。 展开更多
关键词 禽偏肺病毒 荧光RT-lamp 可视化 FD探针 检测方法
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黑木耳菌棒中长枝木霉LAMP可视化检测技术研究
8
作者 朱姝蕊 张传清 《食药用菌》 2025年第4期280-284,共5页
长枝木霉(Trichoderma harzianum)是黑木耳生产中菌棒灭菌不彻底的标志性污染菌之一。为提高长枝木霉在黑木耳菌棒中早期诊断的效率,本研究提出一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术的可视化快速检测方法。研究首先选取长枝木霉的tubulin... 长枝木霉(Trichoderma harzianum)是黑木耳生产中菌棒灭菌不彻底的标志性污染菌之一。为提高长枝木霉在黑木耳菌棒中早期诊断的效率,本研究提出一种基于环介导等温扩增(LAMP)技术的可视化快速检测方法。研究首先选取长枝木霉的tubulin基因作为靶基因,设计特异性引物,初步构建LAMP反应体系。通过在LAMP反应中加入羟基萘酚蓝作为显色剂,实现了对反应产物的颜色判别,从而实现可视化检测。最后,通过优化反应温度(55~66℃,共12个梯度)和反应时间(15~120 min,共8个梯度),提升检测体系的灵敏度。研究结果表明,该体系采取反应温度60℃,反应时间60 min,灵敏度达到10 pg/μL,比传统的PCR方法高出100倍。该方法简便、快速、准确,无需昂贵仪器即可实施,适用于普通实验室和田间的大规模检测,为黑木耳菌棒中长枝木霉的早期诊断与防控提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 长枝木霉 lamp技术 可视化检测 黑木耳菌棒
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草莓白化伴随病毒RT-LAMP检测方法的建立 被引量：1
9
作者 王涌 曾祥国 +4 位作者 肖桂林 温昕 周鑫鑫 邓江丽 韩永超 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期237-245,253,共10页
草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-... 草莓白化伴随病毒(strawberry pallidosis-associated virus,SPaV)能引起草莓白化病,与其他病毒复合侵染后会加重症状。本研究建立了SPaV的反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),对反应体系的各条件进行评估优化后,检测了RT-LAMP的特异性和灵敏度,且对田间样品进行了测试。结果表明,优化后的反应体系包含2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer、6 mmol/L Mg^(2+)、1 mmol/L dNTPs、1μmol/L SPaV-FIP和SPaV-BIP,0.1μmol/L SPaV-F3和SPaV-B3,0.3μmol/L SPaV-LB,0.4 mol/L Betaine,0.256 U/μL WarmStart Bst 2.0 DNA Polymerase,0.12 U/μL WarmStart RTx Reverse Transcriptase,1μL RNA,反应条件为61℃恒温孵育40 min。采用优化后的反应体系,在特异性检测中,只有携带了病毒SPaV的样品才能发生阳性扩增。灵敏度测试中,RT-LAMP比RT-PCR灵敏度高10倍。田间应用中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致。本研究建立的SPaV RT-LAMP检测方法操作简便、快速、特异,可供实验室及生产实践中应用,助力脱毒种苗的鉴定和田间病毒病调查。 展开更多
关键词 草莓白化伴随病毒 反转录环介导等温扩增 可视化 快速检测
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鸡圆圈病毒3型可视化LAMP检测方法的建立及应用 被引量：3
10
作者 张民秀 谢芝勋 +6 位作者 张艳芳 谢志勤 谢丽基 李孟 罗思思 曾婷婷 王粲 《河南农业科学》 北大核心 2024年第4期128-136,共9页
建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方... 建立鸡圆圈病毒3型(GyV3)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为临床上快速检测鸡GyV3提供一种诊断方法。参考GyV3的VP3基因序列,设计1套LAMP特异性引物,分别通过温度优化、引物浓度优化和反应时间的优化,确定鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的扩增温度、引物浓度和反应时间,通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测,验证鸡GyV3可视化LAMP诊断方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。结果显示,鸡GyV3 LAMP检测方法的反应体系:总体积为20.0μL,包括DNA模板1.0μL,2×Master Mix 10.0μL,内引物GyV3-FIP和GyV3-BIP混合液(工作浓度16.0μmol/L)2.0μL,外引物GyV3-F3和GyV3-B3混合液(工作浓度2.0μmol/L)2.0μL,环引物GyV3-LF和GyV3-LB混合液(工作浓度8.0μmol/L)2.0μL,ddH_(2)O 3μL;鸡GyV3 LAMP检测方法的扩增程序:66℃反应20 min,80℃灭活5 min。鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数小于5%;与常规PCR方法检测临床样品的结果比较,两者结果符合率达100%。建立的鸡GyV3可视化LAMP检测方法能特异性检测GyV3,具有特异性好、敏感性高及污染小等优点,且检测结果可通过肉眼观察进行判断,适用于GyV3的临床快速筛查。 展开更多
关键词 鸡圆圈病毒3型(GyV3) 可视化lamp 特异性引物 诊断方法 敏感性
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鸽新城疫病毒可视化LAMP检测方法的建立与应用 被引量：2
11
作者 唐艳荣 张小梅 +3 位作者 郭建立 曹院章 张海云 李壹 《中国家禽》 北大核心 2024年第3期120-124,共5页
为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAM... 为建立一种简便、快速,适用于基层检测鸽Ⅰ型副黏病毒的方法,研究针对鸽Ⅰ型副黏病毒全基因组保守序列,设计了1组可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型分离株的环介导等温扩增(LAMP)引物,通过优化反应条件及体系,建立鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法。结果显示:建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法可检测基因Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅩ、ⅩⅪ型鸽新城疫病毒,与H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、小鹅瘟病毒以及禽白血病病毒以及新城疫病毒La Sota疫苗株均无交叉反应,最低检测限为10^(1)copies/μL。研究表明所建立的鸽Ⅰ型副黏病毒可视化LAMP检测方法快速、简便,特异性强,灵敏度高,可应用于基层快速检测鸽Ⅰ型副黏病毒。 展开更多
关键词 鸽新城疫 lamp 可视化 检测
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鱼类传染性造血器官坏死病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用 被引量：9
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作者 刘淼 徐黎明 +6 位作者 卢彤岩 赵景壮 曹永生 刘红柏 尹家胜 张金凤 冯剑 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期1065-1071,共7页
将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV... 将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本表现为红棕色。2%琼脂糖凝胶电泳检测结果与可视化检测结果一致。该方法实现了检测结果的可视化。特异性分析显示该方法不与传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)及病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)发生交叉反应,并且可检测不低于10 pfu的IHNV RNA。本研究所建立的IHNV RT-LAMP可视化检测方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备的优点,其检测结果直观可视化,可实现现场高通量快速检测。 展开更多
关键词 传染性造血器官坏死病毒(IHNV) 聚合酶蛋白 RT-lamp 可视化检测
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柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用 被引量：23
13
作者 王贤达 林雄杰 +2 位作者 胡菡青 王宗华 范国成 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2014年第5期918-924,共7页
建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1... 建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。 展开更多
关键词 柑橘黄龙病菌 钙黄绿素 环介导等温扩增(lamp) 可视化
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小肠结肠炎耶尔森氏菌可视化LAMP检测方法的建立 被引量：5
14
作者 徐云明 朱孟玲 +12 位作者 杨剑波 孙智远 卞蓉蓉 陈爱宁 郭丽娟 孙玉琴 王一伊 郑墁墁 仲思远 周弇扬 李叶辉 柳增善 任洪林 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期281-288,共8页
通过优化LAMP反应体系中镁离子、甜菜碱、dNTP等反应组成成分,而后进行特异性试验,并优化钙黄绿素与氯化锰的比例放入LAMP体系内,最后应用LAMP检测含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)的肉品,从而建立一种能够检测耶氏菌并通过肉眼观察和... 通过优化LAMP反应体系中镁离子、甜菜碱、dNTP等反应组成成分,而后进行特异性试验,并优化钙黄绿素与氯化锰的比例放入LAMP体系内,最后应用LAMP检测含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)的肉品,从而建立一种能够检测耶氏菌并通过肉眼观察和判断试验结果的LAMP方法。结果显示,优化的25μL反应体系如下:9 mmol/L Mg2+、1.8 mmol/L dNTPs、1.0 mol/L betaine、0.2μmol/L外引物、0.8μmol/L内引物、1μL Bst DNA polymerase(8 U/μL)、2.5μL 10×thermpol reaction buffer、228μmol/L钙黄绿素、324μmol/L氯化锰,反应温度65℃孵育60 min。LAMP检测耶氏菌基因组DNA的最低检测限是85.3×10^(-6)ng/μL,比文献PCR方法灵敏性高出2个数量级。LAMP方法对耶氏菌g DNA的最低检测限对应的基因拷贝数最低检测限是35,对应的CFU最低检测限是7×10^(2)CFU/m L。本试验建立的这种可视化的检测耶氏菌的LAMP方法,为耶氏菌的检测提供了一种新的参考。 展开更多
关键词 小肠结肠炎耶尔森氏菌 lamp 可视化检测
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鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立 被引量：10
15
作者 谢丽基 谢芝勋 +4 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 范晴 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期112-115,共4页
为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h... 为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。 展开更多
关键词 鸭Ⅰ型肝炎病毒 环介导等温扩增 可视化检测
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布鲁氏菌环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法的建立 被引量：27
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作者 许邹亮 南文龙 +6 位作者 周洁 陆明哲 郭玉广 谭鹏飞 毛开荣 彭大新 陈义平 《中国动物检疫》 CAS 2011年第8期37-40,共4页
应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别... 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 环介导等温扩增(lamp) 可视化检测
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猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立 被引量：5
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作者 申世川 王一成 +2 位作者 袁秀芳 徐丽华 李军星 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第1期21-26,共6页
基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DN... 基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 环介导等温扩增 可视化 快速检测
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鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用 被引量：9
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作者 吴植 夏文龙 +3 位作者 蔡树东 郭长明 袁维峰 王永娟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第11期3334-3339,共6页
为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,... 为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) 环介导等温扩增 可视化 快速检测
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非洲马瘟病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立 被引量：9
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作者 李富祥 赵文华 杨仕标 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期579-583,共5页
为建立非洲马瘟病毒(AHSV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据AHSV外衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化建立了AHSV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,本实验所建立RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该... 为建立非洲马瘟病毒(AHSV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据AHSV外衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化建立了AHSV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,本实验所建立RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测进口灭活冻干疫苗中的9个血清型AHSV以及马流感病毒、马传贫病毒、马动脉炎病毒和蓝舌病病毒的RNA,结果显示所有血清型AHSV RNA检测均为阳性,其它病毒RNA检测为阴性,该方法特异性较强;该方法最低可检测到3.2×10-9 ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。利用建立的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法对35份马血和5份驴血样品同时进行检测,结果显示二者阳性和阴性符合率均为100%。本研究在国内外首次建立了AHSV 9种血清型的可视化RT-LAMP检测方法,其具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为非洲马瘟(AHS)快速的可视化现场诊断提供可行方法。 展开更多
关键词 非洲马瘟病毒 反转录环介等温扩增 可视化现场检测
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鹿流行性出血病病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立 被引量：6
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作者 李富祥 赵文华 杨仕标 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期1481-1485,共5页
为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该... 为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒和4个血清型EHDV的RNA样品,结果显示该方法能检测4个血清型EHDV RNA,与其他病毒RNA无交叉反应,特异性较强;该方法最低可检测到4.7×10^-8ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。应用建立的RT-LAMP和普通RT-PCR方法分别对85份牛血液样品进行检测,结果显示,二者阳性和阴性符合率分别为100%和98.8%。本研究建立的EHDV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为牛EHDV感染提供了快速可视化现场检测方法。 展开更多
关键词 鹿流行性出血病病毒 反转录环介等温扩增 可视化现场检测
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