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非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立 被引量:17
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作者 曾少灵 廖立珊 +11 位作者 唐金明 杨俊兴 阮周曦 张彩虹 曹琛福 吕建强 秦智锋 林庆燕 孙洁 叶弈优 谢晓露 花群义 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第1期1-6,共6页
为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合... 为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73蛋白 间接ELISA
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抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白鸡卵黄抗体的制备及鉴定 被引量:6
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作者 张彩虹 祝贺 +8 位作者 高又文 陶虹 刘建利 宗卉 杨俊兴 曹琛福 曾少灵 阮周曦 吕建强 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期821-825,共5页
为研制非洲猪瘟的诊断试剂,将原核表达的非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白纯化后,作为抗原免疫蛋鸡,先后用饱和硫酸铵和硫酸钠对卵黄抗体(IgY抗体)进行分离提取,制备抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性IgY抗体。对初步提纯的IgY抗体进行SDS-PAGE和... 为研制非洲猪瘟的诊断试剂,将原核表达的非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白纯化后,作为抗原免疫蛋鸡,先后用饱和硫酸铵和硫酸钠对卵黄抗体(IgY抗体)进行分离提取,制备抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性IgY抗体。对初步提纯的IgY抗体进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定,并用间接ELISA测定IgY抗体的效价。结果显示,提纯后的IgY抗体有1条重链和1条轻链,分子质量分别约为65ku和26ku;IgY抗体可与非洲猪瘟病毒VP73蛋白发生特异性反应,在约71ku处出现特异性杂交条带;间接ELISA测定的IgY抗体效价约为1∶8 192;浓度测定结果显示,每1mL卵黄液可得到9.2mg卵黄抗体。结果表明,用表达的VP73蛋白作为免疫原制备的特异性IgY抗体具有免疫反应原性,可用于研制非洲猪瘟的诊断试剂。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73蛋白 卵黄抗体
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非洲猪瘟病毒VP73基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达 被引量:4
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作者 常华 花群义 +6 位作者 段纲 杨云庆 周晓黎 董俊 尹尚莲 项勋 曾昭文 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期8-13,共6页
参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列,人工合成的VP73全基因克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,采用PCR扩增得到1188bp的VP73基因;将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆... 参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列,人工合成的VP73全基因克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,采用PCR扩增得到1188bp的VP73基因;将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了非洲猪瘟病毒VP73基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP73蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-Arabinose进行诱导,4h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约60kDa,表达产量约占菌体总蛋白的30%。Western blotting和ELISA检测表明,表达的融合蛋白能与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物为非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白,且具有良好的反应原性,这为应用该表达蛋白抗原制备ASFV免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73基因 克隆 表达
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非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量:5
4
作者 李洪利 王君玮 +7 位作者 张维 吴晓东 赵永刚 李慧 李娟 包静月 曹金山 王志亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第10期7-10,共4页
构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导5h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42ku。蛋... 构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导5h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 vp73 原核表达 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测 被引量:9
5
作者 李倩 姚淑霞 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第18期7680-7682,共3页
[目的]预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位。[方法]综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的抗原表位。[结果]推测B细胞表住位于非洲猪瘟病毒VP73蛋白N端的11-18、26—48、73-82、136—150、... [目的]预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位。[方法]综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的抗原表位。[结果]推测B细胞表住位于非洲猪瘟病毒VP73蛋白N端的11-18、26—48、73-82、136—150、159-174、181-189、191-210、247—276、279-295、313-323和382—392区段内或上述区段附近。[结论]应用多参数预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位,为今后进一步研究非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特征以及表位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73蛋白 B细胞表位
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The Prediction of B Cell Epitopes for VP73 Protein of African Fever Virus 被引量:9
6
作者 李倩 姚淑霞 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第1期89-93,共5页
[Objective] The B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus was predicted. [ Method] Based on the analysis of the amino acid sequence and the flexible regions of VP73 protein, the B cell epitopes for... [Objective] The B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus was predicted. [ Method] Based on the analysis of the amino acid sequence and the flexible regions of VP73 protein, the B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus were predicted by method of Kyte-Doolittie, Emini and Jameson-Wolf. [Result] The B cell epitopes were located at or adjacent to the N-terminal No. 11 - 18,26 -48,73 -82,136 - 150,159 - 174,181 - 189,191 - 210,247 - 276,279 - 295,313 - 323 and 382 - 392. [Conclusion] The multi-parameters analytic method was adopted to predict the B cell epitopes for VP73 protein of African swine fever virus, which laid solid foundation for further characterizing the protein of VP73 and researching epitope vaccine. 展开更多
关键词 African swine fever virus vp73 protein B cell epitope
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非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达 被引量:1
7
作者 李秋霞 滕达 +3 位作者 童德文 杨雅麟 田子罡 王建华 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期60-65,共6页
人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia co... 人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coliBL21(DE3)高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73基因 主要抗原表位区 表达
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非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定
8
作者 董林 王艳萍 +1 位作者 张春玲 沈志强 《家畜生态学报》 北大核心 2013年第4期62-65,共4页
为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73结构蛋白,根据Gen-Bank登录的ASFV基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后... 为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73结构蛋白,根据Gen-Bank登录的ASFV基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化进表达菌株BL21(DM3)中进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,且诱导有效表达了41Ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的35%;Western blot分析表达该蛋白具有良好的表达活性。试验为建立无感染性、快速、敏感的血清学诊断方法奠定了一定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73结构蛋白 表达及鉴定
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抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白单克隆抗体的制备 被引量:2
9
作者 陈轶 吴晓东 +4 位作者 邹艳丽 赵金山 包静月 曹金山 王志亮 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第12期64-67,共4页
为了制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的单克隆抗体(MAb),原核表达并纯化了该病毒的重组VP73蛋白,按常规方法免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法亚克隆,最终获得了一株稳定... 为了制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的单克隆抗体(MAb),原核表达并纯化了该病毒的重组VP73蛋白,按常规方法免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法亚克隆,最终获得了一株稳定分泌抗ASFV VP73蛋白MAb的杂交瘤细胞株,命名为1C8。ELISA检测和Western blot分析表明,所获得的MAb与重组VP73蛋白呈阳性反应,腹水效价为1.024×105,该MAb的抗体类型为IgG1亚类。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73蛋白 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒VP73基因在哺乳动物细胞中的表达 被引量:1
10
作者 靳雯雯 杨晓红 +2 位作者 朱碧波 吕建强 曹胜波 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期574-576,共3页
为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白VP73在哺乳动物细胞中真核表达,本研究根据已发表的ASFV序列,设计合成VP73基因全序列,以巨细胞病毒极早期启动子(CMV-IE)和经水泡性口炎病毒G蛋白(VSV/G)修饰过的pFastBac杆状病毒为载体构建了重... 为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白VP73在哺乳动物细胞中真核表达,本研究根据已发表的ASFV序列,设计合成VP73基因全序列,以巨细胞病毒极早期启动子(CMV-IE)和经水泡性口炎病毒G蛋白(VSV/G)修饰过的pFastBac杆状病毒为载体构建了重组杆状病毒AcNPV-G-VP73。Western blot结果表明,该病毒感染BHK-21哺乳动物细胞后,VP73基因在细胞中获得表达。本研究构建的重组杆状病毒能够介导ASFV VP73蛋白在哺乳动物细胞中表达,为ASF新型疫苗与诊断方法的探索研究奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73基因 重组杆状病毒 哺乳动物细胞
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非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定 被引量:1
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作者 董林 王艳萍 +1 位作者 张春玲 沈志强 《畜牧与兽医》 北大核心 2013年第8期23-26,共4页
根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中。设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切... 根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中。设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21(DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17%,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73 表达
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非洲猪瘟病毒抗体量子点检测试纸条的研制 被引量:21
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作者 林彦星 曹琛福 +8 位作者 张彩虹 孙洁 杨俊兴 廖立珊 黄超华 刘建利 阮周曦 吕建强 花群义 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1214-1220,共7页
根据非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域,合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原,采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记,以抗SPA的多克隆抗体作为... 根据非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域,合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原,采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记,以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白,制备快速检测ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条与常见相关猪疫病阳性血清无交叉反应,与进口ELISA试剂盒对临床样品的检测符合率为100%;特异性强、敏感性高、稳定性好、操作简便,可用于ASFV抗体的快速检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73基因 量子点 免疫层析试纸条
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非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立 被引量:20
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作者 靳雯雯 杨俊兴 +7 位作者 花群俊 刘建利 曹琛福 曹胜波 曾少灵 陶虹 阮周曦 吕建强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期1043-1046,共4页
以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非... 以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 vp73蛋白 间接ELISA
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实验性急性非洲猪瘟肝组织损伤及相关机制的研究 被引量:1
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作者 李樵锋 李慧 +7 位作者 梁浩钊 徐志高 张伟伦 罗颖 许正涛 杨鸿 黄璐琦 邓桦 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第5期31-39,共9页
为探讨非洲猪瘟病毒(ASFV)对肝的组织损伤及其病理机制,本试验人工接种ASFV(Pig/HLJ/18毒株,剂量为210 HAD50/mL),复制急性非洲猪瘟病例,观察13头死亡猪肝脏的剖检变化和组织学变化,采用原位PCR方法,对肝内ASFV病毒VP73蛋白进行定位,以... 为探讨非洲猪瘟病毒(ASFV)对肝的组织损伤及其病理机制,本试验人工接种ASFV(Pig/HLJ/18毒株,剂量为210 HAD50/mL),复制急性非洲猪瘟病例,观察13头死亡猪肝脏的剖检变化和组织学变化,采用原位PCR方法,对肝内ASFV病毒VP73蛋白进行定位,以免疫组织化学方法对肝组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和凋亡因子Bax、Bcl-2的表达进行检测。结果表明,ASFV可对肝的组织结构造成明显损伤,随病程的延长病变逐渐加重,剖检见肝脏淤血、出血,灰白色花斑状炎症灶,胆囊水肿,充血出血。组织学病变以出血和病毒性肝炎为主,肝细胞水肿、坏死和凋亡,淋巴细胞浸润;ASFV主要分布于肝窦、肝小叶汇管区、小叶间质的巨噬细胞;TNF-α、IL-1β、IFN-γ主要在巨噬细胞、肝细胞、血管内皮细胞和少量淋巴细胞中呈阳性表达,其表达强度随损伤程度加重而显著升高(P<0.01);Bax表达升高(P<0.01)的同时Bcl-2表达下降(P<0.01),诱导了细胞凋亡发生。本研究结果提示ASFV通过对肝内单核-巨噬细胞系统的破坏,诱导炎症因子大量释放并激活炎症级联反应,从而造成严重的肝组织损伤。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 vp73 肝组织损伤 炎症因子 BAX BCL-2 病理机制
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Sony新推两款彩色半球型摄像机 Sony SSC-CD43VP/SSC-CD73VP
15
作者 苏锋 《微电脑世界》 2003年第22期118-118,共1页
2003年10月28日.在“2003年国际社会公共安全产品博览会”举办之际Sony(中国)有限公司推出2款最新的彩色半球型摄像机SSC-CD43VP和SSC-CD73VP。新型彩色半球形摄像机具有较高的分辨率和优异的图像质量.同时还具有许多全新性能可很好... 2003年10月28日.在“2003年国际社会公共安全产品博览会”举办之际Sony(中国)有限公司推出2款最新的彩色半球型摄像机SSC-CD43VP和SSC-CD73VP。新型彩色半球形摄像机具有较高的分辨率和优异的图像质量.同时还具有许多全新性能可很好地应用在监视室内、 展开更多
关键词 彩色半球型摄像机 SSC-CD43VP SSC-CD73VP 分辨率 自动变焦镜头 Sony公司
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