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兔瘟病毒VP60基因重组真核表达质粒的构建及其免疫原性 被引量：2
1
作者 鲁忠祥 耿毅 +5 位作者 汪开毓 坤清芳 邓梦玲 邓钊彬 余韬 陈成 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1887-1892,共6页
采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）衣壳蛋白VP60基因，PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体，获得重组质粒pMD19-T-VP60，并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRI与XhoI双酶切后，... 采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）衣壳蛋白VP60基因，PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体，获得重组质粒pMD19-T-VP60，并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRI与XhoI双酶切后，将目的片段VP60插入真核表达载体pVAX-1，构建真核表达质粒pVAX1-VP60。将构建好的重组质粒pVAX1-VP60按500fig／只腿部肌肉注射25日龄家兔，同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。分别于免疫后7，14，21，28，35，42d对各组兔静脉采血，间接ELISA法检测血清中特异性抗体水平，结果显示PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体，pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体，在特异性抗体水平高峰期，2组数据差异不显著（P〉0．05）。于免疫后3，7，14，21，28，35，42d随机剖杀pVAX1-VP60组试验兔3只，取心、肝、脾、肺、肾、腿部肌肉，提取组织DNA，进行PCR检测，结果均检测到目的基因VP60的存在。免疫后28d以滴度10^8的RHDV 0.5mL／只腿部肌肉注射攻毒，pVAX-1组、PBS组、免瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0％，0％，90％，85％，表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。 展开更多
关键词 兔病毒性出血症病毒 vp60 pVAX1-vp60 核酸疫苗 免疫原性
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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析 被引量：20
2
作者 刘怀然 陈洪岩 +4 位作者 关云涛 王云峰 李昌文 夏长友 张立成 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期321-324,共4页
自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为A... 自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%～ 98% ,氨基酸同源性为 94%～ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。 展开更多
关键词 兔 出血症 病毒 衣壳蛋白 vp60 基因克隆 序列分析
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无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达 被引量：14
3
作者 肖跃强 张文倩 +4 位作者 吴信明 管宇 苗立中 王艳 沈志强 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1017-1023,共7页
分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆... 分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 无血凝性 vp60 原核表达 反应原性
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一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析 被引量：10
4
作者 田浪 王红宁 +4 位作者 李建文 廖娟 张夏兰 周万蓉 王鸿宾 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1078-1083,共6页
从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成... 从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 无血凝性 衣壳蛋白 vp60基因 序列分析 RT—PCR
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兔出血症病毒JL株分离鉴定及VP60基因主要抗原表位分析 被引量：11
5
作者 金明兰 侯继波 +4 位作者 郑其升 鲁会军 韩松 南文龙 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期833-838,共6页
采用血凝试验、电镜观察、RT-PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒(RHDV),扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1 740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸... 采用血凝试验、电镜观察、RT-PCR方法分离鉴定了1株JL株兔出血症病毒(RHDV),扩增衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经酶切鉴定后测序。结果显示,VP60基因全长1 740bp,编码580个氨基酸;JL株与其他RHDV分离株比较,核苷酸同源性为93.7%～99.2%,氨基酸同源性在97.3%～99.5%,在VP60 6个区中,A、B、D、F是稳定区,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;将JL株与国内外标准株蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行比较分析,预测RHDV VP60细胞表位。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 分离鉴定 vp60基因 序列分析
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兔出血症病毒VP60基因真核表达质粒的构建及初步评价 被引量：8
6
作者 原冬伟 刘家森 +6 位作者 郭东春 司昌德 姜骞 林欢 穆亚芳 刘行波 曲连东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1582-1586,共5页
利用pMD18-T-VP60质粒(包含RHDV-TP株VP60基因)PCR扩增并酶切回收VP60基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-VP60,对重组质粒进行酶切和PCR鉴定;将重组质粒转染RK13细胞,进行间接免疫荧光和Western-blot检测... 利用pMD18-T-VP60质粒(包含RHDV-TP株VP60基因)PCR扩增并酶切回收VP60基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-VP60,对重组质粒进行酶切和PCR鉴定;将重组质粒转染RK13细胞,进行间接免疫荧光和Western-blot检测;将构建好的重组质粒作为核酸疫苗,腿部肌肉注射免疫小鼠,采用间接ELISA法检测抗体水平;采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞术(FACS)检测细胞免疫情况;采用PCR方法检测重组质粒在小鼠体内的生物安全性。结果显示,成功构建pcDNA-VP60真核表达质粒,并在RK13细胞中获得表达。重组质粒作为核酸疫苗能够诱导小鼠体内产生特异性抗体而且抗体水平随免疫次数增加而逐渐增高,在免疫后49d时达到峰值;脾淋巴细胞刺激指数和CD4+、CD8+淋巴细胞亚群数量百分率明显增高,且与对照组存在明显差异。经PCR鉴定VP60基因未整合到小鼠主要脏器染色体上。结果表明,构建的pcDNA-VP60真核表达质粒能够诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,重组质粒对小鼠是安全的。 展开更多
关键词 核酸疫苗 真核表达 vp60 ELISA T淋巴细胞 PCR检测
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兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用 被引量：7
7
作者 刘怀然 胡迎东 +4 位作者 陈洪岩 张龄 李昌文 关云涛 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期201-204,共4页
VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，... VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白 vp60基因 原核表达 诊斯
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兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析 被引量：7
8
作者 向华 宣华 +2 位作者 王文成 李尚波 魏广森 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期323-326,共4页
以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T... 以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6 展开更多
关键词 兔出血症病毒 CD株 衣壳蛋白 vp60 基因克隆 序列分析
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兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析 被引量：5
9
作者 李传山 杨颖 +2 位作者 张守涛 杨增岐 郭蔼光 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期700-707,共8页
应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。从GenBank... 应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区(西北、华东、东北、西南)的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白(vp60)基因 RT-PCR 生物信息 序列分析
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兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析 被引量：10
10
作者 田浪 王红宁 +3 位作者 李建文 廖娟 张夏兰 王鸿宾 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2005年第12期983-987,共5页
采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90... 采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析. 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白 vp60基因 序列分析
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串叶松香草高效再生体系的建立与兔出血症病毒YL株外壳蛋白基因VP60对其遗传转化 被引量：6
11
作者 李传山 张婷婷 +3 位作者 宋书峰 李维英 孔栋 郭蔼光 《生物技术通报》 CAS CSCD 2007年第5期173-178,共6页
通过对串叶松香草(Silphium perfoliatumL.)不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA0.1(mg/L)培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS+IBA(0.1mg/L)培养基可快速诱导根... 通过对串叶松香草(Silphium perfoliatumL.)不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA0.1(mg/L)培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS+IBA(0.1mg/L)培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。构建了植物表达载体pBI121-VP60,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化串叶松香草以研究高效的串叶松香草转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化外植体、3d预培养时间和3～4d共培养时间、400mg/L羧苄青霉素和40mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,并已筛选到两株拟转基因植株,为利用串叶松香草生产兔出血症病毒动物可食用疫苗建立了初步的技术基础。 展开更多
关键词 串叶松香草 组织培养 vp60基因 根癌农杆菌 遗传转化
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中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定 被引量：14
12
作者 严维巍 崔治中 王永坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期447-449,共3页
应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆... 应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1株 ,在 1.0 m mol/ L IPTG和 37℃的条件下诱导 ,VP6 0 - GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western- blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的 870 0 0相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠 ,所得抗血清应用间接 EL ISA检测 ,与 RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明 ,大肠杆菌中表达的 RHDV VP6 展开更多
关键词 中国株 兔出血症病毒 衣壳蛋白 vp60基因 大肠杆菌 基因表达 免疫原性 鉴定 RT-PCR ELISA 病毒性出血症
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兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达 被引量：3
13
作者 李传山 任力刚 +2 位作者 李维英 杨增岐 郭蔼光 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2007年第11期24-28,共5页
为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),... 为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。 展开更多
关键词 兔出血症病毒(RHDV) 衣壳蛋白(vp60)基因 原核表达 WESTERN BLOT
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兔出血症病毒ZB分离株VP60基因克隆、截短表达与活性鉴定 被引量：3
14
作者 杨丽梅 马力 +6 位作者 张志美 徐倩倩 郭时金 沈志强 李峰 张颖 王艳萍 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第9期57-61,共5页
为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况，并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原，对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达。ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDVVP60基因的核苷酸序列同源性在92．5％～97... 为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况，并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原，对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达。ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDVVP60基因的核苷酸序列同源性在92．5％～97．9％之间，参照ZB株分离病毒VP60基因序列，设计合成一对特异性引物，PCR扩增了876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中，经鉴定正确后，重组质粒转化BL21表达菌，经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白，重组蛋白纯化后，Westernblot检测表明具有良好的抗原性与特异性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 vp60基因 克隆 截短表达
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兔瘟病毒VP60蛋白原核表达及其应用 被引量：3
15
作者 马力 杨丽梅 +3 位作者 王艳 郭时金 沈志强 张颖 《家畜生态学报》 北大核心 2013年第5期67-70,共4页
为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表... 为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 vp60蛋白 原核表达 应用
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VP60 loop区的突变对RHDV VLP功能的影响 被引量：2
16
作者 宋艳华 李珊珊 +5 位作者 王芳 胡波 范志宇 魏后军 薛家宾 徐为中 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期297-304,共8页
[目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-... [目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-417位氨基酸等量替换成柔性氨基酸GSGGSGG,获得重组基因VP60-411-417,利用杆状病毒表达系统获得重组病毒r Ac-VP60-411-417。将重组病毒接种Sf9细胞,通过IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法证明嵌合蛋白P411-417的表达。通过负染透射电镜观察嵌合蛋白VLP的形成,利用血凝试验分析嵌合蛋白的血凝特性,利用合成多糖结合试验分析嵌合蛋白的受体结合特性。[结果]Western blot、IFA和负染透射电镜试验结果显示,嵌合蛋白P411-417得到有效表达,且能够形成完整的VLP;合成多糖结合试验结果显示,嵌合蛋白能够特异性结合HBGA,但其血凝特性消失。[结论]411-417位氨基酸的突变显著影响RHDV的血凝特性,不影响VLP的形成以及结合HBGA的能力,说明该区域是血凝特性的相关位点,但不是HBGA受体结合的关键位点。 展开更多
关键词 兔出血症病毒vp60 重叠延伸PCR 嵌合蛋白 血凝特性 HBGA受体结合
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兔出血症病毒VP60抗原优势区和Th细胞表位融合蛋白的原核表达及免疫效力测定 被引量：2
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作者 孟春春 程英杰 +5 位作者 李传峰 王玢瑸 缪秋红 陈宗艳 吴润 刘光清 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期239-242,共4页
为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB... 为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB-Th融合蛋白。结果显示,融合蛋白以包涵体形式表达,并且具有良好的免疫原性。使用纯化后的融合蛋白免疫实验兔,并分别利用ELISA方法和MTS法检测兔免疫后的抗体水平和淋巴细胞增殖能力。结果表明该融合蛋白能够使兔产生针对RHDV VP60蛋白的特异性抗体和导致高水平的淋巴细胞增殖,并能够为实验兔提供100%的保护。 展开更多
关键词 vp60优势抗原区 Th细胞表位 原核表达 免疫效力测定
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兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性 被引量：6
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作者 刘怀然 刘家森 +3 位作者 胡迎东 陈洪岩 单安山 曲连东 《中国比较医学杂志》 CAS 2007年第8期448-454,F0003,共8页
目的将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及... 目的将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 基因 vp60 昆虫细胞 病毒样颗粒
暂未订购
昆虫细胞表达兔出血症VP60蛋白间接ELISA方法建立及评价 被引量：2
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作者 刘怀然 曲连东 +1 位作者 刘家森 单安山 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期81-88,共8页
采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检... 采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检测RHD抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件和试剂的优化选择,初步组装成间接ELISA试剂盒,并对其整体性能进行了评价。结果表明,含重组VP60蛋白的Sf9细胞裂解液最适包被稀释度为1：2000,换算为纯化VP60蛋白含量约为1.7μg·mL^-1;待检血清最适稀释度为1：100;羊抗兔IgGHRP标记抗体最适使用浓度为1：30000。初步组装的ELISA试剂盒检测RHD阴性血清无假阳性反应,与其他常见兔病阳性血清无交叉反应,特异性良好;敏感性高于RHDV全病毒间接ELISA和血凝抑制试验,低于进口间接ELISA试剂盒;试剂盒批内和批间变异率在10%以内。37℃加速破坏试验和4℃保存期试验结果表明试剂盒保存期可以稳定在6个月。该方法可应用于兔出血症抗体水平监测及实验兔等级检测中。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 vp60基因 昆虫细胞 间接ELISA
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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选 被引量：2
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作者 穆亚芳 刘家森 +5 位作者 郭东春 李茂中 原冬伟 姜骞 林欢 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期354-357,共4页
为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞。以RHDV-V... 为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞。以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆。测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等。本研究鉴定的与RHDVVP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 兔出血症病毒 衣壳蛋白vp60 文库构建
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