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猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:4
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作者 潘向英 曾智勇 +7 位作者 梁海英 汤德元 王彬 叶泥 田红利 边孟婷 柳佳佳 黄书 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1231-1240,共10页
【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6... 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) vp6蛋白 截短表达 间接ELISA
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人A组轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其小鼠多克隆抗体的制备 被引量:1
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作者 张卫斌 吕长坤 +2 位作者 杨颖 王向鹏 王明永 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第9期910-916,共7页
目的表达和纯化人A组轮状病毒VP6蛋白,制备小鼠抗VP6蛋白多克隆抗体。方法通过RT-PCR方法从人A组轮状病毒感染的粪便标本中扩增VP6基因,构建pET-32a-VP6原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖... 目的表达和纯化人A组轮状病毒VP6蛋白,制备小鼠抗VP6蛋白多克隆抗体。方法通过RT-PCR方法从人A组轮状病毒感染的粪便标本中扩增VP6基因,构建pET-32a-VP6原核表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导VP6表达,采用镍柱(Ni-NTA)亲和层析纯化VP6蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting鉴定VP6蛋白;将VP6蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体滴度。结果构建了pET32a-VP6重组表达质粒,VP6蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析法纯化了VP6蛋白,免疫小鼠后获得了多克隆抗体,抗体效价为1∶32000,抗体可以和VP6蛋白发生特异性反应。结论表达和纯化了人A组轮状病毒的VP6蛋白,制备了小鼠抗VP6蛋白的多克隆抗体,为人A组轮状病毒诊断抗原的制备和血清学检测方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 vp6蛋白 原核表达 多克隆抗体
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基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP6 N端蛋白原核表达及多克隆抗体制备
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作者 李威 吴辉亮 +10 位作者 张澳晴 王英英 郑树城 李莹莹 莫绪兵 任燕 潘厚军 尹纪元 施雯 周文礼 王庆 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第4期119-124,共6页
为了给基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV-Ⅱ)诊断方法的建立和相关基因工程疫苗的研制提供材料,试验采用PCR方法扩增了GCRV-ⅡVP6 N端蛋白编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)-VP6... 为了给基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV-Ⅱ)诊断方法的建立和相关基因工程疫苗的研制提供材料,试验采用PCR方法扩增了GCRV-ⅡVP6 N端蛋白编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)-VP6-N,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,构建重组菌pET32a(+)-VP6-N/BL21,经IPTG诱导并优化诱导条件表达GCRV-ⅡVP6 N端蛋白,并对表达的重组蛋白进行可溶性分析,采用Western-blot分析重组蛋白的抗原性,以纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,采用体外中和试验测定多克隆抗体的体外中和效价。结果表明:扩增出大小为684 bp的GCRV-ⅡVP6 N端蛋白编码基因,构建的重组表达质粒pET32a(+)-VP6-N的PCR鉴定、酶切鉴定结果均与预期大小一致且无碱基突变。重组菌pET32a(+)-VP6-N/BL21诱导后超声破碎沉淀在40 ku处出现特异性条带,与预期蛋白质分子质量大小一致;而上清液未出现明显特异性条带。重组蛋白表达的IPTG最佳诱导浓度为0.6 mmoL/L,最佳诱导时间为6 h。重组蛋白能够与GCRV-Ⅱ阳性草鱼血清发生特异性反应,但与健康草鱼血清不发生反应。所制备多克隆抗体效价为1∶1000000,体外中和效价为1∶40。说明试验成功表达了重组GCRV-ⅡVP6 N端蛋白并制备了多克隆抗体,重组蛋白以包涵体形式存在,具有良好抗原性和免疫原性,制备的多克隆抗体效价较高且具有中和活性。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 vp6 N端蛋白 原核表达 多克隆抗体 抗原性 中和活性
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基于猪轮状病毒完整VP6蛋白的间接ELISA方法的建立
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作者 洪雨娟 李本强 +4 位作者 陶洁 程靖华 唐攀 石迎 刘惠莉 《微生物学通报》 北大核心 2025年第10期4839-4847,共9页
【背景】猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是引起猪腹泻的重要病原之一,近期其感染率再次出现升高趋势,有必要加强临床监测以助力该病的防控。【目的】针对PoRV最新流行株的VP6蛋白,建立一种检测PoRV IgG抗体的间接ELISA方法,为临床P... 【背景】猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)是引起猪腹泻的重要病原之一,近期其感染率再次出现升高趋势,有必要加强临床监测以助力该病的防控。【目的】针对PoRV最新流行株的VP6蛋白,建立一种检测PoRV IgG抗体的间接ELISA方法,为临床PoRV抗体普查提供技术支持。【方法】克隆PoRV优势基因型G9P[23]I5的VP6基因并原核表达与鉴定;以VP6重组蛋白作为捕获抗原,与PoRV阳性猪血清进行方阵滴定试验,优化并确定间接ELISA最优参数并分析其特异性、敏感性和重复性。【结果】建立的ELISA技术流程及参数:VP6抗原最佳包被量0.1μg/孔,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉封闭2 h,阳性血清最佳稀释度是1:1000,37℃孵育1 h;Goat pAb to Pig IgG H&L(HRP)(1:15000稀释)37℃孵育1 h,四甲基联苯胺(3,3′,5-5′-tetramethylbenidine,TMB)显色15 min;最佳临界值OD_(450)=0.42,可检测到抗体的最大稀释度为1:8000;批内和批间系数均小于10%;具有较好的特异性;检测130份临床血清样品,此方法与商品化PoRV ELISA检测试剂盒方法的总体符合率达93.85%;本研究建立间接ELISA方法的灵敏度高于商品化PoRV ELISA检测试剂盒。【结论】本研究建立的PoRV抗体间接ELISA方法具有较高的检测可靠性,适用于临床PoRV抗体的大规模筛查。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 间接ELISA vp6重组蛋白 抗体监测
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人A组轮状病毒VP6蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立
5
作者 张卫斌 吕长坤 +2 位作者 杨颖 王明永 王向鹏 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第9期932-938,共7页
目的建立基于人A组轮状病毒(Rotavirus group A,RVA)VP6蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为RVA抗体检测提供技术支持。方法以RVA的VP6蛋白为诊断抗原,用棋盘滴定方法优化ELISA反应条件,建立检测RVA抗体的间接ELISA方法。收集健康儿童血清和... 目的建立基于人A组轮状病毒(Rotavirus group A,RVA)VP6蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为RVA抗体检测提供技术支持。方法以RVA的VP6蛋白为诊断抗原,用棋盘滴定方法优化ELISA反应条件,建立检测RVA抗体的间接ELISA方法。收集健康儿童血清和RVA患者血清,用建立的方法检测血清标本。结果以2µg/mL的VP6蛋白包被酶标板,血清1∶250倍稀释为最佳条件,阴阳性临界值为0.137。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,与Western blotting抗体检测方法符合率为95%。检测370份儿童血清标本,抗体阳性率为81.1%。检测15名RVA患者的急性期和恢复期血清,恢复期血清中RVA抗体滴度相比于急性感染期明显增高。结论建立的ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于RVA抗体检测和RVA感染的辅助诊断。 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 vp6蛋白 间接酶联免疫吸附试验 抗体检测
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人A组轮状病毒VP6单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立和验证
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作者 赵颖 苏韫曦 +7 位作者 刘晓钰 欧阳瑄泽 章青 庞立丽 李金松 李丹地 孙晓曼 段招军 《中国生物制品学杂志》 2025年第3期330-337,343,共9页
目的制备人A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6单克隆抗体(简称单抗),建立双抗体夹心ELISA检测方法,并对方法进行验证及初步应用,为我国RVA的快速诊断、流行病学调查及病毒监测提供更多选择。方法利用杆状病毒系统表达纯化人RVA G9P... 目的制备人A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6单克隆抗体(简称单抗),建立双抗体夹心ELISA检测方法,并对方法进行验证及初步应用,为我国RVA的快速诊断、流行病学调查及病毒监测提供更多选择。方法利用杆状病毒系统表达纯化人RVA G9P[8]株VP6蛋白,免疫5只雌性BALB/c小鼠,制备单抗,间接ELISA法测定单抗的半数效应浓度(EC_(50)),Western blot和间接免疫荧光试验测定单抗与RVA的结合活性。利用单抗配对,其中1株用于包被,另1株进行HRP标记用于检测,建立双抗体夹心ELISA检测方法,并进行灵敏性、特异性和精密性验证。取RV临床粪便样本,分别利用Oxoid ProSpecT商品化试剂盒和建立的双抗体夹心ELISA法进行检测,比较检测结果的符合率。结果纯化得到可溶的VP6蛋白,纯度达90%以上,表达量约为4.5 mg/L。筛选获得2株RVA VP6单抗,命名为1L3和4F22,与VP6蛋白结合的EC_(50)分别为1.777和3.748 ng/mL,2株单抗与RVA可很好的结合。以1L3单抗为捕获抗体,HRP标记的4F22单抗为检测抗体,建立了人RVA双抗体夹心ELISA检测方法。该方法对RVA VP6蛋白的最低检出量为156.25 ng/mL;2株单抗与人诺如病毒(Norovirus,NoV)、札如病毒(Sapovirus,SaV)、腺病毒(adenovirus,AdV)均无交叉反应;批内和批间精密性验证的变异系数(CV)均<10%。该方法检测192份RV临床粪便样本,与商品化试剂盒检测结果比较,阳性符合率为99%,阴性符合率为98%。结论建立的人RVA双抗体夹心ELISA方法具有良好的灵敏性、特异性和精密性,可用于人RVA的检测。 展开更多
关键词 人A组轮状病毒 vp6 真核表达 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
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牛轮状病毒VP6重组蛋白化学发光免疫分析检测方法的建立
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作者 王润清 王媛媛 +4 位作者 孙航 李琦 翟新验 孙雨 张振杰 《中国兽医卫生》 2025年第1期36-43,共8页
实验分析了牛轮状病毒VP6序列的信号肽与跨膜疏水区序列,对所选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成的核苷酸序列连接至pET32a载体,构建重组质粒pET32a-VP6,将重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞株中,扩大培养并成... 实验分析了牛轮状病毒VP6序列的信号肽与跨膜疏水区序列,对所选择的目的基因片段进行稀有密码子优化,将化学合成的核苷酸序列连接至pET32a载体,构建重组质粒pET32a-VP6,将重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞株中,扩大培养并成功诱导表达出纯度较高的包涵体VP6蛋白,蛋白大小约为57 kDa,纯度约为94%,且VP6重组蛋白与其他疫病抗体无非特异性交叉。通过将纯化后的pET32a-VP6重组蛋白作为包被抗原构建牛轮状病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,该方法特异性强,对其余牛类病原无交叉反应,且其组内与组间变异系数均低于12%,具有良好的稳定性与重复性,为开发更为成熟的牛轮状病毒抗体检测试剂盒奠定了基础,具有较高的应用推广价值。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 vp6蛋白 原核表达 蛋白纯化 免疫分析 化学发光
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猪轮状病毒VP6蛋白的真核表达及单克隆抗体制备和应用
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作者 魏黄思梧 张兴艺 +5 位作者 黄校花 刘昌锦 武文杰 沈政乔 罗锋 邓舜洲 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2750-2761,共12页
【目的】制备抗猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6蛋白单克隆抗体,为PoRV检测方法的开发提供参考。【方法】以痘苗病毒启动子P28为VP6的启动子,以G3型PoRV核酸为模板扩增VP6基因,通过无缝克隆方法将VP6基因片段克隆至pSWE178质粒,... 【目的】制备抗猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6蛋白单克隆抗体,为PoRV检测方法的开发提供参考。【方法】以痘苗病毒启动子P28为VP6的启动子,以G3型PoRV核酸为模板扩增VP6基因,通过无缝克隆方法将VP6基因片段克隆至pSWE178质粒,构建重组质粒pSWE178-P28-VP6;利用同源重组和蚀斑纯化技术获得表达VP6蛋白的重组猪痘病毒rSWE178-P28-VP6,用SDS-PAGE鉴定VP6蛋白表达形式。以G9型PoRV为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,以重组病毒表达的VP6蛋白为检测抗原,通过间接ELISA筛选分泌抗VP6单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测单克隆抗体与G3、G4、G5、G9型PoRV的反应原性,选择其中1株单克隆抗体对人工感染PoRV的猪肠道组织进行免疫组化(IHC)检测。【结果】在构建了表达PoRV VP6蛋白的重组质粒pSWE178-P28-VP6基础上,成功构建了表达PoRV VP6蛋白的重组猪痘病毒,表达的蛋白分子质量大小45 ku,为可溶性表达。采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,筛选获得29株分泌抗VP6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,26株单克隆抗体均能与G3、G4、G5、G9型PoRV反应,但荧光亮度存在差异。IHC检测结果显示,单克隆抗体能与感染PoRV的临床样品发生特异性免疫反应。【结论】本研究利用真核表达系统成功表达了PoRV VP6蛋白,采用杂交瘤技术筛选获得29株抗VP6单抗隆抗体,其中26株均能与G3、G4、G5、G9型PoRV反应。试验结果为PoRV免疫学检测方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) vp6蛋白 真核表达 单克隆抗体
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猪轮状病毒重组VP6*蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量:5
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作者 高力国 申翰钦 +3 位作者 陈诒全 陈胜 蔺文成 陈峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4021-4028,共8页
旨在建立猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)的抗体检测方法。本研究以PoRV截短的VP6*(aa149-332)蛋白作为检测抗原,建立PoRV抗体的间接ELISA检测方法。结果显示:截短的重组VP6*(aa149-332)以包涵体和可溶性两种形式存在,大小为22.5 k... 旨在建立猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)的抗体检测方法。本研究以PoRV截短的VP6*(aa149-332)蛋白作为检测抗原,建立PoRV抗体的间接ELISA检测方法。结果显示:截短的重组VP6*(aa149-332)以包涵体和可溶性两种形式存在,大小为22.5 ku。优化后的ELISA反应条件:VP6*(aa149-332)包被量为25 ng·孔^(-1),抗原4℃过夜包被,5%脱脂奶粉溶液37℃封闭2 h,待检血清1∶400稀释、37℃孵育30 min,酶标羊抗鼠IgG二抗1∶24000稀释、37℃孵育30 min,显色15 min。试验确定阴阳性临界值OD_(450 nm)=0.418,可检测到抗体的最大稀释度为1∶3200,批内和批间重复变异系数均小于10%,并具有较好的特异性。28份血清与Western blot结果符合率为96.42%。ELISA OD_(450 nm)值与中和抗体效价log2相关系数R^(2)=0.8785。综上所述,本研究建立的PoRV抗体间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于PoRV的临床血清样本抗体检测。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 vp6*蛋白 间接ELISA 原核表达
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基于VP6蛋白的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量:4
10
作者 刘广阔 邹敏 +5 位作者 吴发兴 于皓同 王凯茸 张锐铮 张琪 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2024年第1期1-6,共6页
为了建立牛轮状病毒(BRV)血清抗体的检测方法,从病料中克隆牛轮状病毒VP6基因,构建其表达载体,利用原核表达技术表达重组VP6蛋白,建立牛轮状病毒血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组VP6蛋白大小为40 ku,以包涵体形式表达,Western ... 为了建立牛轮状病毒(BRV)血清抗体的检测方法,从病料中克隆牛轮状病毒VP6基因,构建其表达载体,利用原核表达技术表达重组VP6蛋白,建立牛轮状病毒血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组VP6蛋白大小为40 ku,以包涵体形式表达,Western blot证实重组VP6蛋白有良好的反应原性;以4μg/mL浓度的抗原包被酶标板,一抗血清50倍稀释,酶标二抗稀释10000倍稀释,为最佳工作条件,阴阳临界值为0.233,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。建立的检测BRV抗体的间接ELISA可用于临床BRV感染的检测。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 vp6蛋白 原核表达 间接酶联免疫吸附试验
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牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:38
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作者 周芳 岳华 +3 位作者 张斌 李凡 陈曦 汤承 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1465-1473,共9页
轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦... 轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVVP6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVVP6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL^(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。 展开更多
关键词 牦牛 轮状病毒 vp6基因 点突变 RT-PCR
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G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征 被引量:9
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作者 李丹地 段招军 +10 位作者 章青 刘娜 谢华萍 崔淑贤 靳淼 杨学梅 郑丽舒 黄灿平 匡治州 王忠山 方肇寅 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期195-201,共7页
最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚... 最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。 展开更多
关键词 人类轮状病毒 VP4 vp6 NSP4 重组
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草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建 被引量:7
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作者 周勇 曾令兵 +3 位作者 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期1-7,共7页
根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾... 根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2.1载体上,经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认后,将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上,成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物载体pCAMBIA 1302-LTB-VP6。本研究旨为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定基础。 展开更多
关键词 草鱼出血病 呼肠孤病毒 vp6基因 LTB基因 植物表达载体
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A组轮状病毒我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达 被引量:7
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作者 李国华 钱渊 +1 位作者 何湘君 霍云雯 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第3期231-237,共7页
通过反转录- 聚合酶链反应( R T- P C R) 获得了轮状病毒地方株 T114 V P6 全基因的c D N A 片段,将其克隆入转移载体质粒p V L1393 中,构建成重组质粒p V L1393 - V P6 。对克隆的 V P6... 通过反转录- 聚合酶链反应( R T- P C R) 获得了轮状病毒地方株 T114 V P6 全基因的c D N A 片段,将其克隆入转移载体质粒p V L1393 中,构建成重组质粒p V L1393 - V P6 。对克隆的 V P6 基因进行序列测定,并用它和杆状病毒( Ac M N P V) 野毒株 D N A 共转染 Sf9 细胞,筛选纯化得到含 V P6 基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白 V P6 的检测。测序结果显示 V P6 基因全长1 356bp ,序列分析显示与 Wa 株非常接近,提示 T114 为亚组Ⅱ病毒株。用高价免疫血清经 Western blot 检测表达产物,结果显示,重组病毒感染细胞裂解液样品中可见大小约45k D 的特异条带;亚组Ⅱ特异性单抗检测到大小约120k D 的条带,提示重组蛋白 V P6 获得了表达,具有正常的抗原反应性和天然 V P6 的三体结构。 展开更多
关键词 vp6 轮状病毒 杆状病毒 表达
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轮状病毒Vp6蛋白的免疫荧光检测 被引量:7
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作者 尹兴晓 文喻玲 +2 位作者 赵庆欢 于洋 陈元鼎 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第5期434-437,共4页
目的检测在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组轮状病毒(Rotavirus,RV)Vp6蛋白和RV SA11感染的MA104细胞中不同时间表达的Vp6蛋白及其分布规律。方法应用纯化的重组A组人轮状病毒TB-Chen株Vp6(rVp6)蛋白和RVSA11分别免疫豚鼠,制备抗血清,以... 目的检测在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组轮状病毒(Rotavirus,RV)Vp6蛋白和RV SA11感染的MA104细胞中不同时间表达的Vp6蛋白及其分布规律。方法应用纯化的重组A组人轮状病毒TB-Chen株Vp6(rVp6)蛋白和RVSA11分别免疫豚鼠,制备抗血清,以抗rVp6豚鼠血清作为检测抗体,应用间接免疫荧光技术检测rVp6蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。分别用抗Vp6和抗RV SA11豚鼠血清检测Vp6蛋白和RV SA11株在感染的MA104细胞中的分布。结果在轮状病毒感染的MA104细胞和大肠杆菌BL21(DE3)中均能检测到轮状病毒Vp6蛋白。以抗RV SA11血清作为一抗检测感染细胞,比用抗rVp6血清检测具有更强的敏感性。结论免疫荧光试验可用于轮状病毒Vp6蛋白的检测。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp6蛋白 免疫荧光
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A群猪轮状病毒VP6结构蛋白在杆状病毒系统中的表达及鉴定 被引量:6
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作者 原霖 张瑜 +6 位作者 刘洋 王婧怡 寇占英 亢文华 杨林 王传彬 倪建强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期476-480,共5页
为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞... 为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆状病毒杆粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rBac-PoRVA-VP6,经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示,表达的PoRVA重组VP6蛋白约45 ku,并且能够被PoRVA阳性血清识别。上述结果表明,经杆状病毒表达系统表达的重组VP6蛋白具有良好的反应原性,为建立PoRVA抗体检测技术奠定了基础。 展开更多
关键词 A群猪轮状病毒 vp6蛋白 杆状病毒表达系统 重组蛋白表达
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猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 被引量:7
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作者 陈淑红 李一经 师东方 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期443-448,共6页
以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯... 以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26.5%,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。 展开更多
关键词 轮状病毒 JL94株 vp6基因 基因克隆 大肠杆菌 基因表达
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转猪轮状病毒VP6基因烟草植物的获得 被引量:5
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作者 张二芹 李世访 +2 位作者 王春凤 钱爱东 成卓敏 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期173-174,共2页
根据G enB ank中轮状病毒VP 6序列设计1对引物,从pGEM-T-VP 6质粒中扩增VP 6 PCR产物。将VP 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou ther... 根据G enB ank中轮状病毒VP 6序列设计1对引物,从pGEM-T-VP 6质粒中扩增VP 6 PCR产物。将VP 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou thern杂交方法进行鉴定,结果表明,VP 6基因已成功地转入烟草中。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 vp6基因 根癌农杆菌LBA4404 烟草 植物疫苗
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牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量:4
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作者 冉旭华 曹思 +4 位作者 刘阳阳 张玲玲 张峣 倪宏波 闻晓波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第7期696-700,共5页
目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a... 目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价>1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 vp6基因 原核细胞 基因表达 多克隆抗体
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草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建 被引量:6
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作者 周勇 范玉顶 +3 位作者 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2009年第4期40-44,共5页
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PC... 以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 vp6基因 植物表达载体 构建
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