基于昆虫细胞表达的鹅细小病毒VP3蛋白的VP3-ELISA诊断方法的建立 被引量：2

1

作者 陈雪明 张树梅 +6 位作者 林委卫 孙悦 陈秀红 呼喝巴特儿 刘明 葛明 张云 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1112-1118,共7页

将鹅细小病毒EP22株VP3基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-Bac-HTB中,酶切鉴定及测序筛选出阳性重组转座载体pFastBac-VP3,转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-VP3,在脂... 将鹅细小病毒EP22株VP3基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-Bac-HTB中,酶切鉴定及测序筛选出阳性重组转座载体pFastBac-VP3,转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-VP3,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得到含鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒rBV-VP3。经SDS-PAGE、Western-blot以及免疫组化试验证实,VP3基因在Sf9细胞中成功表达。利用表达的VP3蛋白建立VP3-ELISA血清学检测方法并对130份鹅血清样品进行检测,以中和试验作为金标准进行对比试验。结果显示,VP3-ELISA检测方法的特异性为100%,敏感性为96.2%,并且VP3-ELISA与其他鹅病阳性血清间不出现交叉反应性。上述研究结果表明,本研究建立的VP3-ELISA是一种特异的、灵敏的血清学诊断方法。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 vp3基因 杆状病毒表达 vp3-elisa

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应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究 被引量：16

2

作者 布日额 李宝臣 +2 位作者 马波 王君伟 Ulrich Neumann 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期199-203,共5页

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅Ig... 利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 vp3基因重组原核表达产物 间接-elisa Dot—ELISA

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传染性法氏囊病病毒VP3抗原表位的鉴定 被引量：1

3

作者 邓小芸 高玉龙 +3 位作者 高宏雷 祁小乐 王晓艳 王笑梅 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期305-311,共7页

利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体（HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E）的抗原表位进行了研究。通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109-119aa（位于IB-DV聚合蛋白的864-874aa）,HRB-7C和HRB-10... 利用肽扫描技术对4株IBDV VP3的单克隆抗体（HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E）的抗原表位进行了研究。通过Western blot和ELISA鉴定,将HRB-3F和HRB-7B的抗原表位定位于VP3 109-119aa（位于IB-DV聚合蛋白的864-874aa）,HRB-7C和HRB-10E的抗原表位定位于VP3 177-190aa（位于IBDV聚合蛋白的932-945aa）。进一步检测其反应原性及免疫原性,结果表明,这两个表位均能与抗IBDV阳性血清反应。将这两个表位短肽免疫BALB/c小鼠,其血清可以和IBDV反应,具有较好的免疫原性。与D6948、HK46和UK661等多株IBDV相应区域的同源性进行了比较,结果显示,这两个表位在多种毒株中同源性为100%。通过IBDV VP3抗原表位的研究,筛出两个新的保守线性表位并进行精确定位,对进一步分析IBDV结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法具有重要的意义。 展开更多

关键词 IBDV vp3 抗原表位 融合表达 WESTERN BLOT ELISA 单抗

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基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：13

4

作者 申水莹 闫若潜 +6 位作者 雷从从 王淑娟 马震原 刘影 赵雪丽 谢彩华 吴志明 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2021年第2期23-30,共8页

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴... 【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组VP3蛋白(rVP3)作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证。将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清,分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测,对比两者检测结果。【结果】成功克隆717 bp的VP3基因,表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白(rVP3)。Western Blot试验结果表明,纯化的rVP3蛋白具有良好的反应原性。建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,当样本OD 450(S)/阳性对照OD 450(P)>0.138时判定为SVA抗体阳性。该方法特异性强,与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应;敏感性较好,检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致;重复性和稳定性好,批内变异系数小于4%,批间变异系数小于9%。160份血清检测结果表明,两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异。【结论】建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。 展开更多

关键词 A型塞内卡病毒 vp3蛋白 间接ELISA 病毒检测

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牛嵴病毒VP3蛋白的原核表达及初步应用 被引量：2

5

作者 王茜 常继涛 +1 位作者 刘云 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期907-910,共4页

牛嵴病毒(BKV)是近几年在牛消化道中新发现的病毒,其致病性尚不清楚。我们的相关研究已表明,该病毒在我国的牛群中普遍存在。为重组表达BKV VP3蛋白,本研究采用RT-PCR方法从牛腹泻粪便样品中扩增BKV VP3蛋白的编码基因,将其克隆至pET-28... 牛嵴病毒(BKV)是近几年在牛消化道中新发现的病毒,其致病性尚不清楚。我们的相关研究已表明,该病毒在我国的牛群中普遍存在。为重组表达BKV VP3蛋白,本研究采用RT-PCR方法从牛腹泻粪便样品中扩增BKV VP3蛋白的编码基因,将其克隆至pET-28a(+)载体中构建原核重组表达质粒pET-VP3。将pET-VP3转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达及SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量约为27.8 ku,以包涵体形式存在。采用电洗脱方法纯化该重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备抗BKV VP3的多克隆抗体。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了间接ELISA抗体检测方法。小范围调查结果显示,在检测的牛群中BKV感染率较高。 展开更多

关键词 牛嵴病毒 vp3蛋白 抗血清 间接ELISA

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猪嵴病毒重组VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立 被引量：5

6

作者 朱庆贺 苗艳 +1 位作者 李文辉 李长龙 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1150-1153,共4页

为建立检测猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)血清抗体的间接ELISA检测方法,以原核表达的重组VP3蛋白为检测抗原,优化ELISA检测条件,建立了PKV抗体的间接ELISA检测方法。该方法仅对PKV血清检测为阳性,对于能够引起猪病毒性腹泻的猪流行... 为建立检测猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)血清抗体的间接ELISA检测方法,以原核表达的重组VP3蛋白为检测抗原,优化ELISA检测条件,建立了PKV抗体的间接ELISA检测方法。该方法仅对PKV血清检测为阳性,对于能够引起猪病毒性腹泻的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒阳性血清检测均为阴性。临床血清样品的检测结果表明,建立的ELISA检测方法与RT-PCR方法的阳性符合率较高。结果表明,建立的以重组VP3蛋白为包被抗原检测PKV血清抗体的ELISA方法可以用于检测PKV的感染及相关流行病学调查。 展开更多

关键词 猪嵴病毒 vp3蛋白 原核表达 间接ELISA

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基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 被引量：3

7

作者 龚如月 于淑媛 +8 位作者 王书博 姜艳平 崔文 乔薪瑗 王丽 周晗 徐义刚 李一经 唐丽杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期678-686,共9页

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋... 本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。 展开更多

关键词 免疫磁珠间接ELISA IBDV抗体检测 IBDV vp3蛋白 毕赤酵母表达系统

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利用VP3蛋白初步建立鸡传染性法氏囊病间接ELISA方法 被引量：1

8

作者 宋铁彬 陈广东 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第1期116-118,共3页

本研究对从河北某鸡场分离的IBDV分离株的VP3基因进行了克隆和表达,将表达蛋白用亲和层析的方法进行纯化,纯化后的蛋白包被ELISA反应板,初步建立了一种用于检测IBDV抗体的间接ELISA方法。

关键词 鸡传染性法氏囊病病毒 vp3蛋白 间接ELISA

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检测小鹅瘟感染抗体的Dot-ELISA方法研究 被引量：4

9

作者 布日额 王君伟 吴金花 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期68-70,共3页

以GPV VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV感染抗体的Dot-ELISA方法,试验确定检测抗原包被浓度分别为700ng;兔抗鹅IgG-HRP-标记抗体的最适稀释度为1∶200;被检血清最佳稀释度为1∶400。检测GPV血清抗体的阳性率... 以GPV VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV感染抗体的Dot-ELISA方法,试验确定检测抗原包被浓度分别为700ng;兔抗鹅IgG-HRP-标记抗体的最适稀释度为1∶200;被检血清最佳稀释度为1∶400。检测GPV血清抗体的阳性率为100%;检测鸡抗GPV VP3禽痘重组病毒血清的阳性率为0%。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 GPV-vp1-vp3非重叠序列 DOT-elisa

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用于检测小鹅瘟抗体的Dot-ELISA建立 被引量：2

10

作者 布日额 王君伟 吴金花 《中国家禽》 北大核心 2009年第11期24-26,共3页

以小鹅瘟病毒(GPV)VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV全病毒抗体与VP3亚单位抗体的Dot-ELISA。该方法中检测抗原包被浓度为70ng/斑点,兔抗鹅IgG-HRP标记抗体的最适稀释度为1∶200,被检血清最佳稀释度为1∶400... 以小鹅瘟病毒(GPV)VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV全病毒抗体与VP3亚单位抗体的Dot-ELISA。该方法中检测抗原包被浓度为70ng/斑点,兔抗鹅IgG-HRP标记抗体的最适稀释度为1∶200,被检血清最佳稀释度为1∶400。特异性试验的结果中,检测抗GPV抗体的阳性率为100%,而抗GPV-VP3禽痘重组病毒抗体的阳性率为0,表明其有很好的特异性与灵敏度。 展开更多

关键词 鹅细小病毒 GPV-(vp1-vp3)非重叠序列 斑点-酶联免疫吸附试验

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禽脑脊髓炎病毒Van Roekel株衣壳蛋白基因原核表达及其ELISA检测研究 被引量：3

11

作者 张二芹 赵心力 +3 位作者 赵振华 孙明 陈西钊 钱爱东 《动物医学进展》 CSCD 2005年第1期55-58,共4页

利用RT PCR方法扩增了禽脑脊髓炎病毒VP0、VP3和VP1基因 ,分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,转化到E .coliER2 566表达菌内 ,经IPTG诱导表达后 ,SDS PAGE分析表达产物。结果表明 ,表达的VP0、VP3、VP1融合蛋白分子量分别为 53 ,53 ,56ku... 利用RT PCR方法扩增了禽脑脊髓炎病毒VP0、VP3和VP1基因 ,分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,转化到E .coliER2 566表达菌内 ,经IPTG诱导表达后 ,SDS PAGE分析表达产物。结果表明 ,表达的VP0、VP3、VP1融合蛋白分子量分别为 53 ,53 ,56ku。以电洗脱法纯化VP0、VP3、VP1表达蛋白抗原并分别建立了间接ELISA方法 ,用阳性血清和阴性血清进行检测。结果显示 ,表达VP1蛋白反应活性相对高于VP0、VP3蛋白反应活性 ,最后再将自制VP1板用自配试剂检测其活性 ,同时用美国试剂盒检测VP1活性 ,美国ELISA试剂盒、琼脂扩散试验检测同样 1 0份血清作比较 ,三组ELISA检测结果 ,其中有 8份被检血清为阳性 ;2份被检血清为阴性。这一结果与琼脂扩散试验检测结果一致。说明VP1表达蛋白活性达到预期要求 。 展开更多

关键词 禽脑脊髓炎病毒 vp0、vp3、vp1基因 原核表达 ELISA

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鸭源新型鹅细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量：2

12

作者 马瑶 汪宏才 +6 位作者 唐晟 姚伦 曾哲 罗青平 曾驰 商雨 温国元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期2042-2049,共8页

新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)变异而来,可感染雏鸭,引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发,严重影响鸭出栏率,给我国的养殖行业带来巨大... 新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)变异而来,可感染雏鸭,引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发,严重影响鸭出栏率,给我国的养殖行业带来巨大的经济损失。为建立一种鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法,用于鸭感染细小病毒的血清学检测和鸭免疫细小病毒疫苗后抗体水平监测,本研究利用生物信息学预测了NGPV YICH株的结构蛋白VP3的抗原表位,选择了抗原富集区域(aa250~525)进行原核表达,经蛋白纯化获得了可溶性的VP3截短蛋白VP3-tr。以VP3-tr为包被抗原,经过棋盘滴定方法优化各个反应条件,建立了NGPV抗体的间接ELISA检测方法。利用优化后的间接ELISA方法对30份GPV阴性鸭血清进行检测,确定阴阳性临界值为0.219。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明,该方法灵敏度较高,特异性良好,不与鸭坦布苏病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸭疫里默杆菌、大肠杆菌病原阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复试验的变异系数均小于6%,重复性良好。用该方法与Western blot检测方法分别对147份临床血清样品进行检测,结果表明ELISA检测阳性率为85.0%,Western blot检测率为69.4%,两者符合率为84.4%。综上所述,本研究成功建立了鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法,为鸭感染NGPV后的感染情况监测以及疫苗免疫评估提供了更简便可靠的方法。 展开更多

关键词 新型鹅细小病毒 vp3蛋白 间接ELISA

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鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立 被引量：1

13

作者 殷茵 张琰杰 +2 位作者 闫艳新 任慧英 刘文华 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第3期53-56,60,共5页

为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法,将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP 3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原,初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。通过条件优化,得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.1595μg/mL,血... 为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法,将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP 3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原,初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。通过条件优化,得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.1595μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶200。结果显示,建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,与商品化的双抗原夹心ELISA的符合率为92.5%,且该方法可同时检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体,因而可用于临床免疫鸭甲肝病毒的种鸭血清抗体水平的检测和卵黄抗体的效价测定。 展开更多

关键词 3型鸭甲肝病毒 vp3蛋白 间接ELISA

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