通过二维病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)鉴定与新城疫病毒和人类呼吸道合胞病毒相互作用细胞蛋白的研究

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作者 Holguera J 吴艳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第9期209-209,共1页

虽然已有研究报道新城疫病毒(NDV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的起始结合受体分别为唾液酸含有分子和黏多糖,但是这2种病毒受体的确切特性仍有待破译。另外,宿主细胞表面的额外分子可能参与病毒侵入机制。本试验运用了病毒覆盖蛋白结合试验(V... 虽然已有研究报道新城疫病毒(NDV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的起始结合受体分别为唾液酸含有分子和黏多糖,但是这2种病毒受体的确切特性仍有待破译。另外,宿主细胞表面的额外分子可能参与病毒侵入机制。本试验运用了病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)来确定细胞表面与NDV和RSV相互作用的细胞蛋白。通过二维凝胶电泳试验及电转到PVDF膜来分离细胞膜,然后采用高浓度病毒将其标记。NDV与一个来自鸡成纤维细胞的蛋白质二硫键异构酶相互作用,而对于RSV,作者检测到15个反应点,鉴定为6个不同蛋白,最为突出的是核仁蛋白。本试验分别讨论了PDI和核仁蛋白在NDV和RSV入侵细胞过程中的可能作用。 展开更多

关键词 新城疫病毒 核仁蛋白 PDI 呼吸道合胞病毒(RSV) 病毒覆盖蛋白结合试验(vopba)

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犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定 被引量：19

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作者 郭爱珍 陆承平 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第2期155-157,共3页

犬瘟热病毒 (CDV)敏感细胞Vero用SDS或RIPA溶解缓冲液溶解 ,利用病毒铺覆蛋白印迹技术 (VOPBA)鉴定犬瘟热病毒疫苗株 (CDV -onderstepoort)的细胞受体。结果发现 ,在Vero细胞上有两组CDV结合蛋白质 ,即高分子量组蛋白质 (12 7kD、12 0kD... 犬瘟热病毒 (CDV)敏感细胞Vero用SDS或RIPA溶解缓冲液溶解 ,利用病毒铺覆蛋白印迹技术 (VOPBA)鉴定犬瘟热病毒疫苗株 (CDV -onderstepoort)的细胞受体。结果发现 ,在Vero细胞上有两组CDV结合蛋白质 ,即高分子量组蛋白质 (12 7kD、12 0kD、110kD)与低分子量组蛋白质 (2 7kD和 30kD)。这些CDV结合蛋白组分的性质及在CDV致病中的作用有待进一步研究。 展开更多

关键词 犬瘟热病毒 病毒受体 vopba 鉴定 致病机理

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鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定 被引量：2

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作者 赵冬敏 韩凯凯 +7 位作者 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓 章丽娇 田宇杰 王梦瑶 李银 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期173-178,共6页

【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅... 【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 鸭胚成纤维细胞 热休克蛋白70 受体 免疫共沉淀 病毒辅覆蛋白结合分析(vopba)

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小反刍兽疫病毒细胞膜受体的鉴定 被引量：1

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作者 蒙学莲 窦永喜 +4 位作者 翟军军 闫丰超 张海瑞 石晓妮 才学鹏 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第9期13-18,23,共7页

【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔... 【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRV-tH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653bp的PPRVtH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Western-blotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 病毒受体 病毒铺覆蛋白结合试验(vopba)

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鸡胚成纤维细胞膜上禽流感病毒受体蛋白的鉴定 被引量：1

5

作者 姜秋杰 王广美 +4 位作者 丁壮 丛彦龙 樊娇 宋德武 李鑫 《吉林畜牧兽医》 2010年第12期6-8,共3页

提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞膜上的受体。结果显示,所提取的细胞膜蛋白中含有8条疑似病毒受体条带。本实验初步鉴定了禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞上的受体蛋白,为揭示流... 提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞膜上的受体。结果显示,所提取的细胞膜蛋白中含有8条疑似病毒受体条带。本实验初步鉴定了禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞上的受体蛋白,为揭示流感病毒感染鸡的机制提供了初步证据。 展开更多

关键词 禽流感病毒 细胞受体 病毒铺覆蛋白印迹技术(vopba)

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凡纳滨对虾鳃细胞膜IHHNV衣壳蛋白受体的筛选 被引量：1

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作者 尹晓彤 费荣梅 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1160-1166,共7页

对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)为对虾主要病毒病之一,近些年,在全球范围内广泛流行并造成严重的经济损失。目前,在流行病学和诊断方面受到重视,但其致病机理鲜有报道。本研究首先构建了IHHNV CP原核表达载体,纯化CP蛋白并制备多... 对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)为对虾主要病毒病之一,近些年,在全球范围内广泛流行并造成严重的经济损失。目前,在流行病学和诊断方面受到重视,但其致病机理鲜有报道。本研究首先构建了IHHNV CP原核表达载体,纯化CP蛋白并制备多抗,抗体效价达到1︰51200;利用匀浆、超速离心方法分离未感染IHHNV的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃细胞膜蛋白;用VOPBA和HIS PULL–DOWN方法筛选凡纳滨对虾鳃细胞膜IHHNV CP受体,分别将疑似的蛋白条带进行LC-MS/MS分析。结果表明,信号转导与转录激活因子(STAT)、热休克蛋白90(HSP 90)、酚氧化酶原2型、Na+/K+-ATP酶α亚基4种蛋白能与IHHNV衣壳蛋白产生相互作用,并具有多种生物学活性,可能参与病毒的入侵及细胞病变的产生。其具体作用有待深入研究。 展开更多

关键词 IHHNV CP 鳃细胞膜蛋白 受体 vopba

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WSSV与IHHNV竞争对虾鳃细胞膜受体的研究

7

作者 王筱珊 胡智博 费荣梅 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期615-622,共8页

本研究对白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)能否竞争虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体进行探索。先用蔗糖梯度离心法提纯WSS... 本研究对白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)与传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)能否竞争虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体进行探索。先用蔗糖梯度离心法提纯WSSV的全蛋白,利用病毒覆盖蛋白印迹技术(VOPBA)与对虾鳃细胞膜NM23蛋白作用,将疑似蛋白条带进行LC-MS/MS分析,初步筛选出3种WSSV蛋白,分别为WSSV013、Wsv497和Wsv035,再构建这3种蛋白的原核表达载体,通过VOPBA和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)验证了Wsv497、Wsv035能与NM23蛋白相互作用,WSSV013不能与NM23蛋白相互作用。初步推测WSSV与IHHNV可能竞争对虾鳃细胞膜上的NM23蛋白受体,该结果为今后研究两种病毒竞争细胞膜受体和虾病毒蛋白作用机制提供理论基础。 展开更多

关键词 WSSV013 Wsv497 Wsv035 vopba 免疫共沉淀 NM23蛋白

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斜纹夜蛾多角体病毒包埋型病毒受体的鉴定 被引量：1

8

作者 尹崇 余健秀 +3 位作者 庞义 胡晓晖 李朝飞 王立华 《中国病毒学》 CSCD 2002年第1期66-68,共3页

蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌｉｔｕｒａ　　ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ，　ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－... 蔗糖密度梯度离心法提纯斜纹夜蛾核多角体病毒（＄Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｌｉｔｕｒａ　　ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｄｒｏｖｉｒｕｓ，　ＳｐｌｔＭＮＰＶ）包埋型病毒粒子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｉｒｕｓ，ＰＤＶ），以此病毒粒子作抗原，免疫家兔获得抗血清；用ＳＤＳ裂解缓冲液提取斜纹夜蛾幼虫中肠组织细胞总蛋白。采用病毒铺覆蛋白印迹技术（ＶＯＰＢＡ），利用抗ＰＶＤ抗血清对病毒受体进行检测，结果表明斜纹夜蛾中肠细胞总蛋白中４０ｋＤ、７３ｋＤ、８５ｋＤ的三种蛋白能够结合ＰＤＶ。 展开更多

关键词 斜纹夜蛾核多角体病毒 包埋型病毒粒子 受体蛋白 病毒铺覆蛋白印迹技术 鉴定

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人血管内皮细胞上与2型登革病毒相互作用蛋白的筛选与鉴定

9

作者 杨杰 饶贤才 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期79-87,共9页

目的建立高效病毒受体筛选方法,筛选并鉴定人血管内皮细胞膜上与2型登革病毒(DENV-2)相互作用的蛋白。方法用纯化的DENV-2 E蛋白DⅢ区(EDⅢ)分子代替全病毒颗粒与转印至PVDF膜的人血管内皮ECV304细胞膜蛋白进行孵育,建立改良的VOPBA和2D... 目的建立高效病毒受体筛选方法,筛选并鉴定人血管内皮细胞膜上与2型登革病毒(DENV-2)相互作用的蛋白。方法用纯化的DENV-2 E蛋白DⅢ区(EDⅢ)分子代替全病毒颗粒与转印至PVDF膜的人血管内皮ECV304细胞膜蛋白进行孵育,建立改良的VOPBA和2D-VOPBA技术筛选相互作用蛋白,筛选出的候选蛋白经质谱分析、Western blot和免疫共沉淀(Co-IP)实验鉴定;利用抗体阻断实验和激光共聚焦显微技术观察和验证候选蛋白与DENV-2感染的关系;经生物信息学分析,预测候选蛋白与DENV-2 EDⅢ蛋白的对接复合物模型及其结合热点残基。结果筛选出相对分子质量34 000、43 000和55 000这3个候选蛋白,其中相对分子质量43 000和55 000蛋白经鉴定分别为细胞骨架微丝蛋白(fibrous-actin,F-actin)和波形蛋白(vimentin),均可与DENV-2 EDⅢ蛋白在体外发生特异性结合,并且vimentin蛋白可表达于人血管内皮细胞表面,其抗体可部分阻断DENV-2感染;激光共聚焦显微镜观察到在DENV-2感染的前5 min就可引起ECV304细胞中actin的重排,并且actin与病毒E蛋白有明显的随感染时间增强的共存现象。最后,利用生物信息学分别预测了actin和vimentin与DENV-2 EDⅢ蛋白的结合模型及结合残基。结论成功建立了高效的病毒受体筛选技术,并证实筛选到的actin和vimentin蛋白可作为辅助受体或相互作用蛋白,通过与DENV-2 EDⅢ蛋白结合参与DENV-2感染人血管内皮细胞。 展开更多

关键词 登革病毒 vopba/2D-vopba 人血管内皮细胞 ACTIN VIMENTIN

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新城疫病毒自然宿主细胞膜受体的鉴定 被引量：4

10

作者 刘伟 丁壮 +3 位作者 宣华 丛彦龙 宋战昀 李少丽 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第8期651-653,共3页

目的鉴定鸡源副黏病毒F48E9株的自然宿主细胞膜受体。方法采用蛋白膜提取试剂盒提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,用改进的间接ELISA方法检测鸡源副黏病毒分离株F48E9与细胞膜的结合活性,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定新城疫病毒(NDV)... 目的鉴定鸡源副黏病毒F48E9株的自然宿主细胞膜受体。方法采用蛋白膜提取试剂盒提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,用改进的间接ELISA方法检测鸡源副黏病毒分离株F48E9与细胞膜的结合活性,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定新城疫病毒(NDV)的自然宿主细胞膜受体。结果NDV与鸡胚成纤维细胞膜有很强的结合力,在转印鸡胚成纤维细胞膜蛋白的PVDF膜上有几条明显的疑似受体条带,相对分子质量介于35000～60000之间。结论初步鉴定了NDV自然宿主细胞膜的受体,其疑似受体蛋白的性质及在新城疫病毒致病中的作用尚有待进一步研究。 展开更多

关键词 新城疫病毒 自然宿主 细胞膜受体 病毒铺覆蛋白印迹技术

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兔出血症病毒肝脏表面蛋白受体的初步筛选

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作者 陈淑慧 刘家森 +6 位作者 黄艳秋 单丽玲 郭东春 姜骞 李志杰 崔玉东 曲连东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1893-1897,共5页

为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在... 为了筛选鉴定兔出血症病毒（RHDV）感染的肝脏细胞表面受体，取成年兔肝脏组织以胰酶消化，经300目铜网过滤，得到完整的兔肝脏细胞。用生物素对细胞表面蛋白进行标记和分离；采用病毒铺覆蛋白技术分析兔肝脏细胞表面蛋白。结果表明，在130000-170000的位置上存在与RHDV相互作用的特异性蛋白条带；利用液相色谱联合质谱技术（LCMS／MS）对特异蛋白条带进行shotgun分析，鉴定得到38个候选蛋白，其中3种蛋白在已知病毒感染过程中具有重要作用。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 病毒铺覆蛋白技术 液相色谱联合质谱 肝脏细胞 表面蛋白

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病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白

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作者 汪沐 绳秀珍 战文斌 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期509-513,共5页

利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现1... 利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现135 kD蛋白由3个蛋白组成,分子量分别为58.3 kD、44.6 kD及37.6 kD;135 kD蛋白SDS-PAGE的VOPBA显示,仅出现37.6 kD的蛋白带,而58.3 kD、44.6 kD蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。结果表明牙鲆FG细胞上135 kD蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白,其37.6 kD蛋白具有病毒结合活性。 展开更多

关键词 非变性电泳 病毒铺膜印迹技术 病毒结合蛋白 淋巴囊肿病毒

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高效薄层层析-病毒覆盖结合法比较细胞表面神经节苷脂与不同动物源性新城疫病毒结合特性 被引量：4

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作者 冯新 宋战昀 +1 位作者 韩文瑜 丁壮 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期263-269,共7页

【目的】神经节苷脂是新城疫病毒入侵宿主细胞的受体,但不同动物源性的新城疫病毒利用受体的特性是否存在差异尚不明确。以鹅源新城疫病毒NA-1株和鸡源新城疫病毒F48E9株为研究对象,比较两株病毒受体结合特性的差异。【方法】提取鸡胚... 【目的】神经节苷脂是新城疫病毒入侵宿主细胞的受体,但不同动物源性的新城疫病毒利用受体的特性是否存在差异尚不明确。以鹅源新城疫病毒NA-1株和鸡源新城疫病毒F48E9株为研究对象,比较两株病毒受体结合特性的差异。【方法】提取鸡胚和鹅胚成纤维细胞新城疫病毒受体成分——神经节苷脂,用高效薄层层析法比较两种细胞所含神经节苷脂的类型和含量;通过高效薄层层析-病毒覆盖结合法比较两种病毒与不同细胞神经节苷脂的结合特性,最后通过病毒红细胞吸附抑制试验进一步验证神经节苷脂与病毒之间的相互作用关系。【结果】鸡胚和鹅胚成纤维细胞所含的神经节苷脂成分存在明显差异;高效薄层层析-病毒覆盖结合实验结果显示NA-1和F48E9与神经节苷脂的结合模式不同,NA-1主要与神经节苷脂GD1a结合,即包含双SAα2,3Gal末端的神经节苷脂,而F48E9可与更多类型的神经节苷脂结合,从单唾液酸到三唾液酸形式的神经节苷脂如GM1、GD1a、GD1b、GT1b等。【结论】鹅源新城疫病毒NA-1株和鸡源新城疫病毒F48E9株在入侵靶细胞时优先选择利用的受体不同。 展开更多

关键词 新城疫病毒 病毒受体 神经节苷脂 薄层色谱 病毒覆盖结合实验

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