为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感...为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感染Vero-SN细胞,经过筛选得到ATG5基因敲除的亚克隆细胞系。利用TCID_(50)和Western-blot技术检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)分别在Vero-SN细胞和ATG5基因敲除细胞系中的复制能力。结果表明,本研究成功建立了VeroSN-ATG5KO细胞系,且抑制细胞自噬不利于病毒复制。该基因敲除细胞系的建立为后续探究病毒与自噬蛋白的相互作用及分子机制提供了试验材料。展开更多
目的采用BALB/c小鼠免疫结合ELISA法,建立新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)体内效力检验方法,探讨其影响因素后,进行方法验证。方法新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠14 d后,摘眼球采血并分离血清及灭活,采用ELISA法检测小鼠血清...目的采用BALB/c小鼠免疫结合ELISA法,建立新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)体内效力检验方法,探讨其影响因素后,进行方法验证。方法新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠14 d后,摘眼球采血并分离血清及灭活,采用ELISA法检测小鼠血清中特异性新型冠状病毒抗体效价。对小鼠2种动物来源和3种周龄以及检测试剂盒内关键试剂(包被板、酶稀释液、酶标抗体)各3批进行结果比对分析,并按照《中国药典》四部(2020版)9401生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则,对建立的方法进行精密度、专属性、相对准确度验证;采用建立的方法对10批新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)半成品的体内效力进行检测。结果3批样品免疫不同来源小鼠检测结果的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)为17.1%~30.3%,2种来源小鼠检测结果在95%置信区间内差异无统计学意义(t=0.25,P>0.05);同一批样品免疫不同周龄小鼠检测结果GCV为10.9%。同一批试剂盒、同一批抗体及不同批酶稀释液检测的A_(450-630)值GCV为4.8%,同一批试剂盒、同一批酶稀释液及不同批抗体检测的A_(450-630)值GCV为9.9%,同一批抗体、同一批酶稀释液及不同批酶标板检测的A_(450-630)值GCV为6.3%;同一实验人员对同一批半成品重复检测6次,GCV为9.1%~23.8%,不同实验人员在不同时间、不同地点检测的GCV为24.9%;氢氧化铝佐剂和阴性对照组抗体效价几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)的GCV为8.4%;同一样品在4个不同稀释度的相对偏倚(relative bias,RB)为-25.0%~21.7%。10批疫苗参考品效价为1131~2263,GCV为13.0%。结论建立的小鼠免疫结合ELISA法具有较高的准确度、精密度,较好的专属性,可用于新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)体内效力检测,可作为产品有效性评价指标。展开更多
文摘为探讨病毒如何利用宿主细胞自噬机制进行复制和传播提供研究模型,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建ATG5基因敲除细胞系。首先针对非洲绿猴肾细胞(Vero)的ATG5基因设计靶向sgRNA序列,并将其连接到慢病毒载体中,包装得到重组慢病毒,用其感染Vero-SN细胞,经过筛选得到ATG5基因敲除的亚克隆细胞系。利用TCID_(50)和Western-blot技术检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)分别在Vero-SN细胞和ATG5基因敲除细胞系中的复制能力。结果表明,本研究成功建立了VeroSN-ATG5KO细胞系,且抑制细胞自噬不利于病毒复制。该基因敲除细胞系的建立为后续探究病毒与自噬蛋白的相互作用及分子机制提供了试验材料。
文摘目的采用BALB/c小鼠免疫结合ELISA法,建立新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)体内效力检验方法,探讨其影响因素后,进行方法验证。方法新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠14 d后,摘眼球采血并分离血清及灭活,采用ELISA法检测小鼠血清中特异性新型冠状病毒抗体效价。对小鼠2种动物来源和3种周龄以及检测试剂盒内关键试剂(包被板、酶稀释液、酶标抗体)各3批进行结果比对分析,并按照《中国药典》四部(2020版)9401生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则,对建立的方法进行精密度、专属性、相对准确度验证;采用建立的方法对10批新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)半成品的体内效力进行检测。结果3批样品免疫不同来源小鼠检测结果的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)为17.1%~30.3%,2种来源小鼠检测结果在95%置信区间内差异无统计学意义(t=0.25,P>0.05);同一批样品免疫不同周龄小鼠检测结果GCV为10.9%。同一批试剂盒、同一批抗体及不同批酶稀释液检测的A_(450-630)值GCV为4.8%,同一批试剂盒、同一批酶稀释液及不同批抗体检测的A_(450-630)值GCV为9.9%,同一批抗体、同一批酶稀释液及不同批酶标板检测的A_(450-630)值GCV为6.3%;同一实验人员对同一批半成品重复检测6次,GCV为9.1%~23.8%,不同实验人员在不同时间、不同地点检测的GCV为24.9%;氢氧化铝佐剂和阴性对照组抗体效价几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)的GCV为8.4%;同一样品在4个不同稀释度的相对偏倚(relative bias,RB)为-25.0%~21.7%。10批疫苗参考品效价为1131~2263,GCV为13.0%。结论建立的小鼠免疫结合ELISA法具有较高的准确度、精密度,较好的专属性,可用于新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)体内效力检测,可作为产品有效性评价指标。
