目的探究新鱼腥草素钠(sodium new houttuyfonate,SNH)通过泛素特异性肽酶22(ubiquitin-specific peptidase22,USP22)介导的沉默调节蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)去泛素化调控自噬抑制肝细胞癌...目的探究新鱼腥草素钠(sodium new houttuyfonate,SNH)通过泛素特异性肽酶22(ubiquitin-specific peptidase22,USP22)介导的沉默调节蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)去泛素化调控自噬抑制肝细胞癌进展的作用机制。方法人肝癌HepG2细胞给予SNH或索拉非尼处理24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力。质粒转染诱导USP22过表达,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)验证USP22和SIRT1之间的相互作用,Western blotting检测USP22、SIRT1蛋白表达和SIRT1泛素化水平。使用SIRT1激活剂处理后,通过m RFP-GFP-LC3双荧光标记、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平测定、乳酸生成测定以及USP22、SIRT1、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ/Ⅰ、p62的蛋白表达分析评估自噬活性。在体内实验中,40只BALB/c-nu裸鼠异位移植HepG2细胞,给予SNH或索拉非尼干预12 d,每3天监测肿瘤体积和质量。对肿瘤组织进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、TUNEL染色,采用免疫组化法检测核增殖抗原Ki67、USP22和SIRT1的蛋白表达。结果SNH呈剂量相关性地抑制HepG2细胞活力和侵袭(P<0.01、0.001),诱导细胞凋亡(P<0.001),其中高剂量SNH的作用与索拉非尼相当。Co-IP证实了USP22-SIRT1蛋白相互作用,高剂量SNH显著降低USP22-SIRT1蛋白相互作用(P<0.01)。高剂量SNH显著下调USP22和SIRT1蛋白表达(P<0.01、0.001),增加SIRT1的泛素化(P<0.001),以上作用被USP22过表达逆转(P<0.05、0.001)。SNH抑制HepG2细胞自噬,表现为GFP/mRFP荧光信号增强(P<0.01),ATP水平降低(P<0.001),乳酸水平升高(P<0.001),p62表达增加以及USP22、SIRT1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05、0.001)。SIRT1激活部分抵消了SNH的自噬抑制作用(P<0.05、0.01、0.001)。在体内,高剂量SNH显著降低肿瘤体积、质量和恶性程度(P<0.001),诱导肿瘤细胞凋亡以及Ki67、USP22和SIRT1表达降低(P<0.001)。结论SNH调控USP22表达介导SIRT1去泛素化来抑制自噬,从而抑制肝细胞癌的进展,为肝细胞癌的治疗提供了潜在策略。展开更多
文摘目的探究新鱼腥草素钠(sodium new houttuyfonate,SNH)通过泛素特异性肽酶22(ubiquitin-specific peptidase22,USP22)介导的沉默调节蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)去泛素化调控自噬抑制肝细胞癌进展的作用机制。方法人肝癌HepG2细胞给予SNH或索拉非尼处理24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭能力。质粒转染诱导USP22过表达,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)验证USP22和SIRT1之间的相互作用,Western blotting检测USP22、SIRT1蛋白表达和SIRT1泛素化水平。使用SIRT1激活剂处理后,通过m RFP-GFP-LC3双荧光标记、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平测定、乳酸生成测定以及USP22、SIRT1、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ/Ⅰ、p62的蛋白表达分析评估自噬活性。在体内实验中,40只BALB/c-nu裸鼠异位移植HepG2细胞,给予SNH或索拉非尼干预12 d,每3天监测肿瘤体积和质量。对肿瘤组织进行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、TUNEL染色,采用免疫组化法检测核增殖抗原Ki67、USP22和SIRT1的蛋白表达。结果SNH呈剂量相关性地抑制HepG2细胞活力和侵袭(P<0.01、0.001),诱导细胞凋亡(P<0.001),其中高剂量SNH的作用与索拉非尼相当。Co-IP证实了USP22-SIRT1蛋白相互作用,高剂量SNH显著降低USP22-SIRT1蛋白相互作用(P<0.01)。高剂量SNH显著下调USP22和SIRT1蛋白表达(P<0.01、0.001),增加SIRT1的泛素化(P<0.001),以上作用被USP22过表达逆转(P<0.05、0.001)。SNH抑制HepG2细胞自噬,表现为GFP/mRFP荧光信号增强(P<0.01),ATP水平降低(P<0.001),乳酸水平升高(P<0.001),p62表达增加以及USP22、SIRT1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05、0.001)。SIRT1激活部分抵消了SNH的自噬抑制作用(P<0.05、0.01、0.001)。在体内,高剂量SNH显著降低肿瘤体积、质量和恶性程度(P<0.001),诱导肿瘤细胞凋亡以及Ki67、USP22和SIRT1表达降低(P<0.001)。结论SNH调控USP22表达介导SIRT1去泛素化来抑制自噬,从而抑制肝细胞癌的进展,为肝细胞癌的治疗提供了潜在策略。
文摘目的探讨USP22基因表达沉默对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法将9只BALB/C祼鼠随机分为阴性对照组、CNE-2空载体细胞株组(Scrambled组)、USP22表达下调稳定细胞株组(sh-USP22组),每组3只裸鼠。绘制各组肿瘤生长曲线;移植瘤中USP22 m RNA及蛋白的表达情况通过RT-PCR、免疫组织化学法检测。结果 sh-USP22组肿瘤重量[(0.54±0.07)g]明显小于阴性对照组[(1.58±0.24)g]和Scrambled组[(1.46±0.23)g],差异均有统计学意义(均P<0.05);RT-PCR结果表明,以阴性对照组表达量为参照(1),sh-USP22组肿瘤组织中USP22m RNA相对表达量(0.14±0.09)低于阴性对照组和Scrambled组(0.92±0.11),差异均有统计学意义(均P<0.05);而阴性对照组和Scrambled组(0.92±0.11)比较,差异无统计学意义(P>0.05);免疫组化结果表明,sh-USP22组肿瘤组织中USP22阳性细胞所占比率[(12.45±1.16)%]明显低于阴性对照组[(97.25±1.94)%]和Scrambled组[(91.28±2.75)%],差异均有统计学意义(均P<0.05);阴性对照组[(97.25±1.94)%]和Scrambled组[(91.28±2.75)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒载体sh-USP22能有效抑制USP22基因表达,并有效抑制CNE-2细胞的裸鼠成瘤能力,USP22有望成为鼻咽癌基因治疗新靶点。
