目的探究补肾健脾法对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬的影响。方法将72只SD大鼠分为六组:正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组和补肾健脾+3-MA组。正常组和诱导组给予超纯水,其他组给...目的探究补肾健脾法对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬的影响。方法将72只SD大鼠分为六组:正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组和补肾健脾+3-MA组。正常组和诱导组给予超纯水,其他组给予特定药物,补肾健脾组和补肾健脾+3-MA组给予相同药物。7 d后收集血液制备含药血清。BMSCs复苏后,转移到相应的培养瓶中,按照大鼠的分组进行培养,并使用含药血清的培养基培养15 d。通过CCK8实验检测细胞在24、48、72 h的增殖情况;使用ELISA法测定碱性磷酸酶(ALP)及活性氧(ROS)的表达;通过茜素红染色观察成骨细胞(OB)的矿化结节;免疫荧光染色检测线粒体远红外荧光探针(Mito-Tracker Deep Red FM)与线粒体自噬相关蛋白LC3的共定位情况,并通过Image J软件分析细胞的平均荧光强度;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、p-FUNDC1(Ser17)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达。结果①在24、48、72 h,细胞增殖呈上升趋势,补肾健脾组的促进效果最为显著;②ALP表达在不同药物干预下增加、ROS降低,补肾健脾组的效果最为明显;③茜素红染色显示,各组细胞形成不同程度的矿化结节,补肾健脾组的结节面积最大,成骨效果最佳;④线粒体荧光共定位结果表明,药物干预可提高细胞线粒体自噬水平,补肾健脾组的LC3荧光强度最高;⑤线粒体自噬蛋白检测结果显示,与诱导组相比,各治疗组均能提升ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、p-FUNDC1(Ser17)蛋白的表达,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表明补肾健脾组的线粒体自噬水平最高。结论补肾健脾治法可能通过调节ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬途径,促进BMSCs的成骨分化。展开更多
文摘目的探究补肾健脾法对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬的影响。方法将72只SD大鼠分为六组:正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组和补肾健脾+3-MA组。正常组和诱导组给予超纯水,其他组给予特定药物,补肾健脾组和补肾健脾+3-MA组给予相同药物。7 d后收集血液制备含药血清。BMSCs复苏后,转移到相应的培养瓶中,按照大鼠的分组进行培养,并使用含药血清的培养基培养15 d。通过CCK8实验检测细胞在24、48、72 h的增殖情况;使用ELISA法测定碱性磷酸酶(ALP)及活性氧(ROS)的表达;通过茜素红染色观察成骨细胞(OB)的矿化结节;免疫荧光染色检测线粒体远红外荧光探针(Mito-Tracker Deep Red FM)与线粒体自噬相关蛋白LC3的共定位情况,并通过Image J软件分析细胞的平均荧光强度;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、p-FUNDC1(Ser17)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达。结果①在24、48、72 h,细胞增殖呈上升趋势,补肾健脾组的促进效果最为显著;②ALP表达在不同药物干预下增加、ROS降低,补肾健脾组的效果最为明显;③茜素红染色显示,各组细胞形成不同程度的矿化结节,补肾健脾组的结节面积最大,成骨效果最佳;④线粒体荧光共定位结果表明,药物干预可提高细胞线粒体自噬水平,补肾健脾组的LC3荧光强度最高;⑤线粒体自噬蛋白检测结果显示,与诱导组相比,各治疗组均能提升ULK1、p-ULK1(Ser555)、FUNDC1、p-FUNDC1(Ser17)蛋白的表达,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值表明补肾健脾组的线粒体自噬水平最高。结论补肾健脾治法可能通过调节ULK1/FUNDC1介导的线粒体自噬途径,促进BMSCs的成骨分化。
