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UL56基因下游3513bp对鸭肠炎病毒生物特性的影响 被引量：2
1
作者 毛娅卿 张兵 +8 位作者 王团结 侯力丹 黄小洁 刘丹 赵俊杰 李启红 王乐元 李俊平 杨承槐 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第23期4390-4397,共8页
【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158-162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′... 【目的】鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率,已报道了多株DEV的全基因组序列,DEV基因组大,长度约158-162 kb。与疫苗株相比,DEV疫苗检验用参考强毒株基因组UL区5′端连续插入3513 bp(2716-6228位核苷酸)导致UL56基因移框突变。目前关于DEV基因功能、致病机理等报道较少。本研究通过构建了重组病毒,以研究连续3513 bp插入对DEV生物特性的影响;【方法】以提取的DEV基因组DNA为模板,分别扩增UL56基因上下游两端同源臂UL56-u、UL56-d。将两同源臂片段克隆到pMD18T-Simple载体,获得重组质粒pT-UL56ud。将重组质粒pT-UL56ud用Mlu I酶切,电泳回收去磷酸化后,将红色荧光蛋白(RFP)表达盒插入到pT-UL56ud中,获得重组质粒pT-UL56-RFP。DEV接种鸭胚成纤维细胞(DEF)(MOI=0.1),吸附1-2 h后,按Lipofectamine 2000说明书转染高纯质粒pT-UL56-RFP,通过同源重组的方法,以红色荧光蛋白(RFP)基因为报告基因,构建了缺失DEV UL56下游3513bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。将重组病毒及其亲本病毒分别接种25 cm^2的细胞瓶中(MOI=0.01),测量其病毒含量,绘制一步生长曲线;将重组病毒及其亲本病毒分别作适当稀释,接种已长成单层DEF,加入M199营养琼脂糖覆盖,培养5-7 d,随机选取20个蚀斑,测量蚀斑面积;将重组病毒、回复株及其亲本病毒分别以10^5.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行致病性试验,观察10 d,每天记录发病死亡情况。试验结束后剖检所有存活鸭。对全部动物取肝脏组织,固定于4%多聚甲醛溶液,按常规程序制备病理切片并进行H.E染色;将重组病毒及鸭瘟商品化活疫苗株(CVCC AV1222)分别以10^3.0TCID50肌肉注射6周龄易感麻鸭进行免疫原性试验,在免疫后14 d,腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCC AV1221),每只10^3.0MLD。观察10 d,每天记录发病死亡情况。【结果】通过同源重组的方法,获得携带RFP的重组病毒DEV△3513-RFP、缺失DEV UL56下游3513 bp的重组病毒DEV△3513及其回复株DEVΔ3513(R)。重组病毒DEVΔ3513、DEVΔ3513(R)及其亲本毒均在接种DEF后72 h,病毒含量达到峰值(10^6.2-6.5TCID50/0.1 mL),病毒含量无明显差异;均能在DEF细胞中形成清晰蚀斑,大小无明显差异;DEVΔ3513对6周龄易感麻鸭毒力明显减弱,未出现任何临床症状和死亡;DEVΔ3513以10^3.0TCID50/只免疫麻鸭,能抵抗DEV强毒株的攻击;【结论】成功构建了缺失UL56基因下游3513 bp的重组病毒,首次证实UL56基因下游3513 bp对DEV在细胞中的复制是非必需的;缺失UL56基因下游3513 bp后病毒仍保留良好的免疫原性;UL56基因下游3513 bp是DEV的一个毒力决定因子。 展开更多
关键词 鸭肠炎病毒 ul56基因下游3513 BP 重组病毒 生物特性
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传染性喉气管炎病毒UL56蛋白在不同感染模式中的表达及其亚细胞定位分析 被引量：1
2
作者 马德青 张金城 +4 位作者 徐贝贝 冯伟民 陈鑫 韦平 黄腾 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期817-822,共6页
传染性喉气管炎病毒(ILTV)编码的UL56蛋白在进化上非常保守,其功能尚不清楚。为明确UL56蛋白在鸡胚肾(CEK)细胞和气管环(TOC)两种不同感染模式中的表达特征及其在HEK293T细胞中的亚细胞定位,本研究分别构建了野生型ILTV UL56的重组质粒p... 传染性喉气管炎病毒(ILTV)编码的UL56蛋白在进化上非常保守,其功能尚不清楚。为明确UL56蛋白在鸡胚肾(CEK)细胞和气管环(TOC)两种不同感染模式中的表达特征及其在HEK293T细胞中的亚细胞定位,本研究分别构建了野生型ILTV UL56的重组质粒pUL56(WT)、其关键结构域突变体的质粒pUL56(AY)将UL56氨基酸序列中两个PY基序(PY motif)的脯氨酸(Pro,P)均突变为丙氨酸(Ala,A)及pUL56(ΔTMD)(删除UL56氨基酸序列中的跨膜域TMD),将这3个质粒分别转染DF-1细胞后均经western blot鉴定。结果显示,分别获得了约81 ku的特异性条带,表明野生型UL56及其突变体均获得了表达。以5000 EID_(50)/mL ILTV疫苗株K317分别感染CEK和TOC后不同时间,利用兔UL56多克隆抗体通过western blot检测UL56蛋白表达的变化。结果显示,UL56蛋白在两种不同感染模式中的表达特征明显不同。CEK中的UL56蛋白从感染后24 h开始表达,48 h达到高峰后逐渐下降;而TOC中UL56蛋白的表达量则持续上升,至感染后96 h达到峰值。将pUL56(WT)、pUL56(AY)和pUL56(ΔTMD)分别转染HEK293T细胞后瞬时表达UL56蛋白及其突变体,经高尔基体标志蛋白58k的抗体孵育后,通过激光共聚焦试验观察UL56蛋白的亚细胞定位。结果显示UL56蛋白主要定位于高尔基体,且亚细胞定位不受其PY motif的影响而受其TMD的影响。本研究首次揭示了ILTV感染细胞和离体组织后UL56蛋白表达的特征,并鉴定了影响其亚细胞定位的关键结构域,为后续探究该蛋白的分子作用机制和生物学功能奠定了实验基础。 展开更多
关键词 传染性喉气管炎病毒 ul56 表达规律 亚细胞定位
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伪狂犬病病毒变异株UL43和UL56基因失活株的构建与生物学特性分析
3
作者 吕家轩 张传健 +3 位作者 王志胜 何青 王继春 费荣梅 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2022年第6期34-41,共8页
为探究UL43与UL56基因失活对伪狂犬病病毒(PRV)变异株毒力的影响,本研究基于伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA细菌人工染色体(BAC)BACPRV-G,应用En Passant操作技术,分别将UL43与UL56基因的起始密码子进行点突变,获得两株重组BAC株:BACPRV... 为探究UL43与UL56基因失活对伪狂犬病病毒(PRV)变异株毒力的影响,本研究基于伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA细菌人工染色体(BAC)BACPRV-G,应用En Passant操作技术,分别将UL43与UL56基因的起始密码子进行点突变,获得两株重组BAC株:BACPRV-G-UL43^(mut)与BACPRV-G-UL56^(mut)。之后将携带同源臂的PRV AH02LA gE/gI基因分别于BACPRV-G-UL43^(mut)和BACPRV-G-UL56^(mut)共转染猪睾丸(ST)细胞,从而获得重组病毒PRV-UL43^(mut)和PRV-UL56^(mut)。生长动力学试验显示PRV-UL43^(mut)病毒滴度在感染后12 h有升高趋势,表明UL43基因可能在感染细胞早期抑制病毒增殖;PRV-UL56^(mut)与亲本毒株PRV AH02LA生长动力学相似,表明UL56基因对病毒生长性能无显著影响。荧光定量PCR试验发现UL56基因可抑制感染细胞早期主要组织相容性复合物Ⅰ类分子的转录。此外,小鼠致病力试验显示,相较于亲本毒PRV AH02LA(LD_(50)=10-3.26/0.2 mL),PRV-UL43^(mut)(LD_(50)=10-2.63/0.2 mL)与PRV-UL56^(mut)(LD_(50)=10-2.19/0.2 mL)对小鼠的致病力均降低,表明UL43基因与UL56基因可能介导病毒对小鼠的致病性。本研究成功构建了PRV变异株UL43、UL56基因失活株,为进一步揭示PRV免疫逃逸的机制奠定基础,也为研制更加安全有效的PRV弱毒疫苗提供理论依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 细菌人工染色体 UL43 ul56 点突变 生物学特性
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马疱疹病毒1型UL56蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
4
作者 张玉鉴 撒瑞雪 +7 位作者 吴桂灵 杨凯舒 张嗣玉 李银涛 齐晋卫 杨贤斌 邓智超 刘建华 《现代畜牧科技》 2024年第4期1-6,共6页
为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多... 为制备马疱疹病毒1型(EHV-1)UL56蛋白(pUL56)的多克隆抗体。该研究根据GenBank中EHV-1 YM2019株全基因组序列,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠并制备pUL56多克隆抗体,经Western blot与间接ELISA试验测定多克隆抗体反应性。结果显示,纯化后的pUL56可以与EHV-1阳性血清发生反应;pUL56多克隆抗体的效价为1∶128 000,并能与pUL56特异性结合。本研究成功制备具有良好反应性的pUL56多克隆抗体,为pUL56功能特性及EHV-1致病机制的研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 马疱疹病毒1型 ul56蛋白 原核表达 多克隆抗体
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