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植物和细菌TurboID邻近蛋白标记方法的建立
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作者 王芳 邵会茹 +4 位作者 吕林龙 赵点 胡振 吕建珍 姜亮 《生物技术通报》 北大核心 2025年第9期44-53,共10页
【目的】TurboID邻近蛋白标记技术是一种基于生物素连接酶的新型蛋白互作研究技术,具有标记速度快、时空分辨率高和毒性小等优点。目前该技术仍处于逐步推广阶段,并在少数物种中得到应用。通过构建多种代表性物种的TurboID表达系统,评... 【目的】TurboID邻近蛋白标记技术是一种基于生物素连接酶的新型蛋白互作研究技术,具有标记速度快、时空分辨率高和毒性小等优点。目前该技术仍处于逐步推广阶段,并在少数物种中得到应用。通过构建多种代表性物种的TurboID表达系统,评估其在单子叶植物、双子叶植物及原核生物中的标记效能和应用范围。【方法】分别构建在单子叶植物[水稻(Oryza sativa)]、双子叶植物[拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)]和细菌[大肠杆菌(Escherichia coli)]中表达“标签蛋白+TurboID”融合蛋白的载体,并将其转化至相应物种。通过生物素溶液处理转基因材料后提取总蛋白,利用标签蛋白免疫印迹检测融合蛋白的表达情况,并通过生物素免疫印迹检测内源蛋白的标记情况。【结果】在植物中采用泛素启动子、细菌中采用T7启动子驱动表达,实现了“标签蛋白+TurboID”融合蛋白在拟南芥、番茄、烟草、水稻愈伤组织和大肠杆菌中的高效表达。免疫印迹显示融合蛋白表达良好,且经生物素处理后,各系统中均有多种内源蛋白被有效标记,表明所构建的TurboID系统在单子叶植物、双子叶植物及原核生物中均具有良好适用性和推广潜力。【结论】成功在单子叶植物、双子叶植物和细菌中建立了TurboID邻近蛋白标记方法,为复杂蛋白互作网络分析提供了高效、可靠的技术平台。 展开更多
关键词 turboid 邻近蛋白标记 生物素 生物素连接酶 蛋白互作 拟南芥 水稻
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基于片段互补策略的Split-TurboID体系构建及其在细胞间通信研究中的应用
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作者 耿丹丹 张心如 +2 位作者 韩毅 赵章婷 安利伟 《同济大学学报(医学版)》 2025年第3期311-318,共8页
目的基于片段互补策略构建Split-TurboID技术体系,实现对细胞间相互作用蛋白的高效、特异性标记。方法构建基于分泌型和可介导细胞间直接互作的N-TurboID和C-TurboID非活性片段,并验证其在细胞中的表达和定位。通过Western印迹法、免疫... 目的基于片段互补策略构建Split-TurboID技术体系,实现对细胞间相互作用蛋白的高效、特异性标记。方法构建基于分泌型和可介导细胞间直接互作的N-TurboID和C-TurboID非活性片段,并验证其在细胞中的表达和定位。通过Western印迹法、免疫荧光法和流式细胞术评估Split-TurboID技术的标记能力。结果成功构建并验证了自发诱导与诱饵蛋白互作诱导的Split-TurboID技术体系。Western印迹法、免疫荧光法和流式细胞术结果表明,N-TurboID和C-TurboID片段在靠近时彼此具有高亲和力,可重新组成具有活性的TurboID酶,再通过生物素标记后,可实现探究分泌型蛋白质互作和细胞间直接相互作用。结论Split-TurboID技术为细胞间相互作用的研究提供了高效、灵活且特异性强的生物素标记方法,为探索细胞间通信提供了有力的技术支持。 展开更多
关键词 片段互补策略 Split-turboid 邻近标记技术 蛋白质相互作用 细胞间通信
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基于TurboID邻近蛋白标记技术鉴定细胞内Smad3相互作用网络
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作者 张璐娜 倪玉芳 +4 位作者 鲜茜雯 王洪连 粟宏伟 王丽 李健春 《西南医科大学学报》 2025年第1期36-40,共5页
目的利用生物素标记酶TurboID介导的邻近标记技术,筛选并构建转录因子Smad3的活性调控网络。方法构建一个含有Smad3和TurboID基因序列的诱导型表达质粒,并通过慢病毒介导的转染方法将其导入Smad3敲除的肾小管上皮细胞TCMK1中,形成过表... 目的利用生物素标记酶TurboID介导的邻近标记技术,筛选并构建转录因子Smad3的活性调控网络。方法构建一个含有Smad3和TurboID基因序列的诱导型表达质粒,并通过慢病毒介导的转染方法将其导入Smad3敲除的肾小管上皮细胞TCMK1中,形成过表达的稳定转染细胞系。在建立稳定转染细胞系的基础上,首先确定了适合的生物素标记浓度和时间,随后进行了生物素标记实验。通过链霉亲和素磁珠对带有生物素标记的蛋白复合物进行富集和纯化,随后进行蛋白质谱分析,并筛选出与Smad3相互作用的候选蛋白。结果在Smad3敲除的肾小管上皮细胞TCMK1中成功构建了Smad3-TurboID诱导型过表达稳转细胞株。经过生物素标记实验优化,最终确定的生物素浓度和标记时间为25μm和20 min。质谱结果分析筛选出一系列潜在和Smad3相互作为候选蛋白,例如Yap1和Stat3。结论结合生物素标记酶TurboID介导的邻近标记技术,本研究成功地鉴定了大量可能与Smad3相互作用的候选蛋白。这些发现为后续深入研究Smad3蛋白的功能及其在细胞内的调控网络提供了理论基础。通过这些互作蛋白的识别和功能分析,将有助于更全面地理解Smad3的生物学作用。 展开更多
关键词 邻近标记 高效蛋白质鉴定技术 母细胞分化蛋白3 肾小管上皮细胞
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TurboID技术在疾病蛋白质组学中的发展与应用 被引量:3
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作者 张芷源(综述) 丁明(审校) 《现代医药卫生》 2023年第18期3173-3177,共5页
蛋白质是生命物质的基础,其通过与其他生物分子形成复合物或蛋白-蛋白相互作用来维持细胞完整结构和功能,控制不同的生命过程。研究蛋白质相互作用的传统方法具有一定的局限性,邻近依赖生物素鉴定技术的出现可以在一定程度上弥补缺陷。... 蛋白质是生命物质的基础,其通过与其他生物分子形成复合物或蛋白-蛋白相互作用来维持细胞完整结构和功能,控制不同的生命过程。研究蛋白质相互作用的传统方法具有一定的局限性,邻近依赖生物素鉴定技术的出现可以在一定程度上弥补缺陷。而进一步优化后的TurboID技术,适用于捕捉微弱/瞬时的蛋白质相互作用的信号,并且实现了对于特殊细胞类型罕见蛋白、不溶性蛋白及空间特殊蛋白的识别。随着TurboID技术的不断优化,其逐渐在各个领域成为一种有力的研究工具,尤其是在研究各类疾病的发生机制与药物靶标筛选中发挥重要作用。该文主要总结了TurboID技术及其发展过程,并讨论了其在疾病蛋白质组学中的应用。 展开更多
关键词 蛋白质-蛋白质相互作用 邻近标记 turboid miniturboid Split-turboid 综述
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利用TurboID邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法 被引量:1
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作者 刘佳欣 何明良 +5 位作者 刘颖湘 卜庆云 李秀峰 王臻昱 刘剑锋 田晓杰 《土壤与作物》 2023年第3期256-263,共8页
TurboID邻近蛋白标记(TurboID-based proximity labeling,TbPL)技术是将诱饵蛋白融合TurboID生物素连接酶,在该工具酶的作用下将生物素标记到邻近蛋白上,最终通过链酶亲和素偶连磁珠将邻近蛋白富集下来,通过质谱分析的方式获得互作蛋白... TurboID邻近蛋白标记(TurboID-based proximity labeling,TbPL)技术是将诱饵蛋白融合TurboID生物素连接酶,在该工具酶的作用下将生物素标记到邻近蛋白上,最终通过链酶亲和素偶连磁珠将邻近蛋白富集下来,通过质谱分析的方式获得互作蛋白组。本文主要以水稻重要转录因子OsWRKY53为例,详细描述了利用TbPL技术获得水稻互作蛋白组的方法和注意事项。 展开更多
关键词 水稻 turboid 邻近蛋白标记 互作蛋白组 实验方法
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基于TurboID的植物蛋白邻近标记实验方法 被引量:4
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作者 邝嘉怡 李洪清 +1 位作者 沈文锦 高彩吉 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期584-593,共10页
邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术,已成功应用于多种动植物体系的研究。该技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的酶,在酶的催化作用下将小分子底物(如生物素)共价连... 邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术,已成功应用于多种动植物体系的研究。该技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的酶,在酶的催化作用下将小分子底物(如生物素)共价连接到酶邻近的内源蛋白,通过富集和分析被标记的蛋白可获得与诱饵互作的蛋白组。经定向进化产生的生物素连接酶TurboID具有无蛋白毒性及催化效率高的优势。利用TurboID介导的邻近标记技术分析感兴趣蛋白的邻近蛋白组,可研究细胞内瞬时发生或微弱的蛋白互作网络,进而解析复杂的生物学过程。该文详细描述了在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中基于TurboID的邻近标记实验方法及注意事项,旨在为利用这一新技术研究植物蛋白互作关系提供参考。 展开更多
关键词 turboid 邻近标记 生物素 蛋白互作
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TurboID Proximity Labeling of a Protocadherin Protein to Characterize Interacting Protein Complex 被引量:1
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作者 Chenyu Wang Laidong Yu 《American Journal of Molecular Biology》 2023年第4期213-226,共14页
The study of the neuron has always been a fundamental aspect when it came to studying mental illnesses such as autism and depression. The protein protocadherin-9 (PCDH9) is an important transmembrane protein in the de... The study of the neuron has always been a fundamental aspect when it came to studying mental illnesses such as autism and depression. The protein protocadherin-9 (PCDH9) is an important transmembrane protein in the development of the neuron synapse. Hence, research on its protein interactome is key to understanding its functionality and specific properties. A newly discovered biotin ligase, TurboID, is a proximity labeler that is designed to be able to label and observe transmembrane proteins, something that previous methods struggled with. The TurboID method is verified in HEK293T cells and primary cultured mouse cortical neurons. Results have proven the validity of the TurboID method in observing PCDH9-interacting proteins. 展开更多
关键词 turboid PCDH9 Proximity Labeling Protein Interactome Synapse Development
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Proximity labeling proteomics with cilia-TurboID transgenic mice identified regulators of motile cilia function
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作者 Pan Wang Xiangnan Wu +9 位作者 Liqing Xiao Qingru Yu Yan Peng Mengting Yan Jun Tang Mingqiang Hu Hongtao Li Li Li Lingfei Luo Ming Ma 《Journal of Genetics and Genomics》 2025年第11期1413-1416,共4页
Cilia are indispensable for organ development and function,and their dysfunction causes a range of syndromic diseases known as ciliopathies,including obesity,cystic kidney disease,situs inversus,and male infertility(R... Cilia are indispensable for organ development and function,and their dysfunction causes a range of syndromic diseases known as ciliopathies,including obesity,cystic kidney disease,situs inversus,and male infertility(Reiter and Leroux,2017;Wallmeier et al.,2020).To date,over 180 ciliopathy-associated genes have been identified(Reiter and Leroux,2017),yet the underlying mechanisms remain poorly understood. 展开更多
关键词 proteomics proximity labeling syndromic diseases obesitycystic kidney diseasesitus male infertility reiter regulators cilia turboid transgenic mice organ development
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利用邻位标记-质谱联用技术发掘冠状病毒HCoV-229E互作宿主因子
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作者 琚睿霞 汪浩勇 +2 位作者 刘海楠 刘萱 曹诚 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第11期3011-3020,共10页
目的通过邻位标记-质谱联用与生物信息学分析结合筛选与人冠状病毒229E(HCoV-229E)核衣壳蛋白(NP)相互作用的潜在宿主因子,并利用免疫共沉淀等技术验证,寻找HCoV-229E NP的相互作用蛋白,为揭示病毒复制增殖的分子机制,及不同人冠状病毒... 目的通过邻位标记-质谱联用与生物信息学分析结合筛选与人冠状病毒229E(HCoV-229E)核衣壳蛋白(NP)相互作用的潜在宿主因子,并利用免疫共沉淀等技术验证,寻找HCoV-229E NP的相互作用蛋白,为揭示病毒复制增殖的分子机制,及不同人冠状病毒致病力差异奠定基础。方法首先构建了表达HCoV-229E NP与生物素连接酶标签融合蛋白(NP-TurboID)的重组腺病毒Ad-V5-NP^(HCoV-229E)-TurboID(Ad-N),感染人非小细胞肺癌细胞A549,48 h后添加外源生物素,通过生物素连接酶标记NP相互作用蛋白,利用链霉亲和素交联的磁珠纯化生物素标记蛋白,而后进行无标记(label-free)蛋白质组学质谱分析,筛选出潜在的与NP互作的蛋白质,并通过免疫沉淀和免疫荧光等实验进行验证。结果无标记蛋白质组学质谱筛选出584个潜在互作蛋白,从中选取糖原合成酶激酶3(GSK3)A和GSK3B进行免疫共沉淀和免疫荧光验证,实验结果表明,二者与NP^(HCoV-229E)存在相互作用。结论邻位标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用因子的挖掘,为进一步研究冠状病毒复制、增殖及致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 邻位标记 冠状病毒229E 核衣壳蛋白 turboid 糖原合成酶激酶3
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利用邻近标记-质谱联用技术筛选埃博拉病毒相关宿主因子 被引量:1
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作者 张迅 柏宇 +2 位作者 刘海楠 刘萱 曹诚 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期92-97,共6页
构建VP35与生物素连接酶TurboID融合蛋白,利用埃博拉病毒最小基因组系统(Ebola virus minigenome system, EBOV MG),在细胞中模拟病毒的生命周期和病毒包涵体(virus inlusion body, VIB)的形成过程,通过添加外源生物素,标记VP35相互作... 构建VP35与生物素连接酶TurboID融合蛋白,利用埃博拉病毒最小基因组系统(Ebola virus minigenome system, EBOV MG),在细胞中模拟病毒的生命周期和病毒包涵体(virus inlusion body, VIB)的形成过程,通过添加外源生物素,标记VP35相互作用蛋白。定量质谱丰度差异分析筛选出537个潜在的VP35互作蛋白,Gene Ontology(GO)分析发现其中包括大量与RNA结合相关蛋白。从中选取EIF4B和ZNF598进行初步验证,二者均与VP35存在相互作用,且敲低上述基因可显著抑制EBOV转录复制病毒样颗粒(trVLP)的复制效率。结果证实,邻近标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用蛋白挖掘,为病毒致病机制研究及抗病毒靶点挖掘提供重要手段。 展开更多
关键词 邻近标记 埃博拉病毒 病毒包涵体 turboid VP35
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基于生物素连接酶的邻近标记技术在蛋白质组学中的研究进展 被引量:5
11
作者 张雨欣 丁明 柳军 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期18-24,共7页
基于生物素酶的蛋白质邻近标记技术是利用融合在感兴趣蛋白上的生物素连接酶对邻近的蛋白质生物素化,通过生物素与链酶亲和素之间的亲和力进行分离,再结合质谱分析鉴定出生物素化蛋白。该技术能够用于检测弱而短暂的蛋白质相互作用,也... 基于生物素酶的蛋白质邻近标记技术是利用融合在感兴趣蛋白上的生物素连接酶对邻近的蛋白质生物素化,通过生物素与链酶亲和素之间的亲和力进行分离,再结合质谱分析鉴定出生物素化蛋白。该技术能够用于检测弱而短暂的蛋白质相互作用,也给在无膜细胞器和其他不易分离或纯化的亚细胞结构的上的蛋白互作研究提供了新的选择,很好地补充了传统研究蛋白质互作方法的空白。本文对近几年出现的基于生物素酶的蛋白质邻近标记的技术发展及其应用进行了综述。 展开更多
关键词 邻近标记技术 生物素化 蛋白质相互作用 BioID BioID2 turboid 进展
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活细胞内亚细胞结构蛋白质组学研究新技术——几种邻近标记策略的应用及比较 被引量:4
12
作者 杜阳春 唐菁兰 +1 位作者 王友军 张晓嫣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第7期641-653,共13页
真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的... 真核细胞内多种无膜及有膜细胞器为各种生物学过程的发生提供场所.被膜细胞器通过它们之间的膜接触位点所进行的信息交流和物质交换是维持生命活动所必需的.绘制活细胞中细胞器或膜接触位点等处的蛋白质组图谱,将有助于解析这些部位的生物学功能及作用机制,并为研究细胞器相互作用提供基础.但由于无膜细胞器或膜接触位点很难分离纯化,传统的生化方法难以系统解析其中的蛋白质组.最近报道的几种基于酶类的蛋白质邻近标记技术,则为系统分析上述空间受限的蛋白质组这一难题提供了有效的解决方案.通过将能催化产生活性自由基(最常见的是生物素及其衍生物的自由基)的酶连接到目标蛋白上,可对其邻近的蛋白质组进行共价标记,从而使后者的分离和鉴定成为可能,并可以运用于活细胞中的动态标记.我们在此综述了几种最新的邻近标记策略的原理及应用,并对它们的优势与局限性进行了比较,以期为细胞器互作的蛋白质组学研究提供参考. 展开更多
关键词 细胞器蛋白质组 膜接触位点 亚细胞区室 蛋白质相互作用 邻近标记 BirA APEX BioID turboid
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一种细胞内快速标记邻近蛋白复合物的新方法 被引量:2
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作者 刘健 周姗 +1 位作者 戴大鹏 蔡剑平 《医学研究杂志》 2020年第5期26-30,共5页
目的构建可诱导、细胞适用性广的细胞内快速标记邻近蛋白复合物新方法。方法体外合成TurboID编码基因,并与Tet-on系统一并插入改造后的慢病毒载体,病毒包装后侵染HeLa细胞以融合表达TurboID及目的蛋白YB1或对照蛋白GFP。使用不同浓度的... 目的构建可诱导、细胞适用性广的细胞内快速标记邻近蛋白复合物新方法。方法体外合成TurboID编码基因,并与Tet-on系统一并插入改造后的慢病毒载体,病毒包装后侵染HeLa细胞以融合表达TurboID及目的蛋白YB1或对照蛋白GFP。使用不同浓度的强力霉素处理细胞24h以诱导融合蛋白的表达,加入50μmol/L生物素继续培养15~120min以使TurboID将临近蛋白进行生物素标记,免疫印迹法检测生物素标记的蛋白含量。结果成功构建了可诱导的TurboID融合表达慢病毒载体。获得的病毒侵染HeLa细胞,应用0.125μg/ml以上的强力霉素即可诱导细胞产生TurboID融合蛋白。生物素处理15min以上可得到大量生物素标记的蛋白。结论构建了快速标记邻近蛋白复合物的检测体系——TurboID系统,该系统具有可诱导、生物素标记迅速及细胞适用性广等优点,可广泛应用于大多数动物及人体细胞内蛋白复合物的筛查研究。 展开更多
关键词 邻近蛋白标记 turboid 蛋白复合物 生物素化 载体构建
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运用化学遗传学方法鉴定星形胶质细胞调控抑制性突触形成的关键蛋白 被引量:2
14
作者 苏一洵 李晖 易陈菊 《神经损伤与功能重建》 2022年第1期1-3,共3页
星形胶质细胞对神经元突触的形成起着重要作用。但由于缺乏体内研究细胞之间互作蛋白的技术手段,我们对星形胶质细胞与神经元的互作机制了解有限。近来,来自杜克大学的Cagla Eroglu团队和Scott H.Soderling团队在Nature杂志上发表的文章... 星形胶质细胞对神经元突触的形成起着重要作用。但由于缺乏体内研究细胞之间互作蛋白的技术手段,我们对星形胶质细胞与神经元的互作机制了解有限。近来,来自杜克大学的Cagla Eroglu团队和Scott H.Soderling团队在Nature杂志上发表的文章,报道了一种利用在体化学遗传学的Split-TurboID方法,并利用该方法鉴定了星形胶质细胞中与神经元表面互作的蛋白,发现星形胶质细胞NrCAM蛋白可通过与神经元NrCAM互作,负调控星形胶质细胞的体积大小,并在神经元桥尾蛋白介导下促进抑制性突触形成。 展开更多
关键词 星形胶质细胞 抑制性突触 Split-turboid 神经黏附分子
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星形胶质细胞U251稳转FOXO1基因细胞系构建及其蛋白互作生物素验证
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作者 曾挺 郭媛媛 +2 位作者 郭婕妤 刘超 刘武 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期799-800,共2页
蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是细胞生命活动的基础,以BioID和APEX为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究[1,2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氢键、盐键和疏水相互作用力进行,它们的空... 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPIs)是细胞生命活动的基础,以BioID和APEX为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究[1,2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氢键、盐键和疏水相互作用力进行,它们的空间距离都非常的短,所以通常认为互作的蛋白必定相互邻近[3]。TurboID是一种比BioID或APEX具有更高催化效率的蛋白质(标记时间从18 h缩短至10 min),由于很多蛋白发挥的结合与催化作用是很短暂的,理论上利用这个技术可以找到一些比较新颖的结合蛋白[4]。大量研究表明,FOXO1调控许多靶点,如参与细胞凋亡和自噬的基因、抗氧化酶、细胞周期阻滞基因以及代谢和免疫调节因子[5-6],被认为是一种具有复杂活性的超级转录因子。因此,我们将利用TurboID的高效性来寻找FOXO1的互作蛋白。 展开更多
关键词 FOXO1 turboid 稳转细胞系 蛋白互作 生物素 银染色法
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