针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系...针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系统优化TUNEL染色中的关键参数(蛋白酶K浓度:8~15μg/mL;孵育条件:37℃、15 min)及染色顺序,研究结果显示:对比普通荧光染色与TSA荧光染色的性能差异,TSA技术荧光信号强度明显提升,同时保留更完整的细胞形态结构,且突破抗体种属限制;在多重染色流程中,“抗原修复→TSA荧光染色→蛋白酶K消化→TUNEL染色”的顺序方案显著优于另外2种染色流程,其有效性在小鼠结肠肿瘤及皮下瘤模型中均得到验证;优化后的TUNEL-TSA多重荧光标记方法具有信号增强显著、结构完整性高、检测灵敏度与特异性优异和抗体兼容性强等优势。我们的研究为建立标准化原位细胞凋亡相关免疫因子检测体系提供了技术支撑,并具备广阔的临床应用前景。展开更多
文摘针对传统TUNEL联合普通多重荧光染色法存在的信号弱、多重染色效果差及抗体种属限制等问题,本研究采用酪酰胺信号放大技术(tyramide signal amplification,TSA),对大鼠心肌梗死模型的TUNEL联合免疫荧光多重染色方法进行了改良优化。系统优化TUNEL染色中的关键参数(蛋白酶K浓度:8~15μg/mL;孵育条件:37℃、15 min)及染色顺序,研究结果显示:对比普通荧光染色与TSA荧光染色的性能差异,TSA技术荧光信号强度明显提升,同时保留更完整的细胞形态结构,且突破抗体种属限制;在多重染色流程中,“抗原修复→TSA荧光染色→蛋白酶K消化→TUNEL染色”的顺序方案显著优于另外2种染色流程,其有效性在小鼠结肠肿瘤及皮下瘤模型中均得到验证;优化后的TUNEL-TSA多重荧光标记方法具有信号增强显著、结构完整性高、检测灵敏度与特异性优异和抗体兼容性强等优势。我们的研究为建立标准化原位细胞凋亡相关免疫因子检测体系提供了技术支撑,并具备广阔的临床应用前景。
文摘目的：利用Hoechst33342/PI双染法和原位末端标记法（TUNEL染色检测纳米二氧化硅（nm-SiO2）对神经细胞凋亡的影响，比较两种检测方法的优缺点。方法：以体外培养的人神经母细胞瘤SK-N-SH为研究对象，15和30 nm粒径的nm-SiO2（剂量为2.5、5、10μg/mL）分别处理细胞24 h，另设1-5 m SiO2组和溶剂对照组，采用Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色检测各处理组对SK-N-SH细胞凋亡的影响。结果：与对照组相比，两种检测方法分析均显示了nm-SiO2处理组SK-N-SH细胞凋亡率显著增加（P〈0.05），且具有尺寸、剂量依赖性，而微米级SiO2对凋亡的影响不显著（P〉0.05）。结论：nm-SiO2能诱导SK-N-SH细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染法特异性高，简单易行；TUNEL法灵敏度高，能检测少量的细胞凋亡，但成本较高，两种方法可结合使用以便更加准确的检测神经细胞的凋亡。
