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吕氏泰勒虫TlSP基因的克隆和原核表达 被引量：5
1
作者 何海宁 李有全 +4 位作者 刘志杰 杨吉飞 陈泽 罗建勋 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1139-1143,共5页
为克隆表达吕氏泰勒虫TlSP基因的功能区片段并对其表达蛋白进行免疫印迹分析,以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板,PCR扩增出TlSP基因片段,克隆至pET-30a载体。将成功构建的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS,诱导表达产物用镍... 为克隆表达吕氏泰勒虫TlSP基因的功能区片段并对其表达蛋白进行免疫印迹分析,以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板,PCR扩增出TlSP基因片段,克隆至pET-30a载体。将成功构建的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS,诱导表达产物用镍柱进行亲和层析纯化,并用Western-blot分析TlSP表达蛋白与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫以及环形泰勒虫阳性血清是否产生交叉反应。结果表明,TlSP基因获得了可溶性表达蛋白,并且重组表达蛋白TlSP分别与上述3种泰勒虫阳性血清存在交叉反应。证实TlSP同源基因也存在于环形泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,这为今后深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病的免疫学诊断和亚单位疫苗研究中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 吕氏泰勒虫 tlsp基因 原核表达 纯化 免疫印迹
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吕氏泰勒虫TlSP基因在真核细胞中的表达与定位 被引量：3
2
作者 何海宁 刘志杰 +9 位作者 杨吉飞 陈泽 关贵全 王雅 刘爱红 任巧云 罗建勋 殷宏 赵萍 李有全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期919-923,共5页
为研究吕氏泰勒虫TlSP基因在真核细胞中的表达与亚细胞定位,构建了pEGFP-N1-TlSP重组表达质粒,经脂质体转染Vero细胞后,用Western-blot验证了该蛋白在Vero细胞的表达;用荧光显微镜和激光共聚焦显微成像技术确定了TlSP重组蛋白在真核细... 为研究吕氏泰勒虫TlSP基因在真核细胞中的表达与亚细胞定位,构建了pEGFP-N1-TlSP重组表达质粒,经脂质体转染Vero细胞后,用Western-blot验证了该蛋白在Vero细胞的表达;用荧光显微镜和激光共聚焦显微成像技术确定了TlSP重组蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果表明重组质粒pEGFP-N1-TlSP在Vero细胞中获得了表达,绿色荧光主要聚集于细胞浆,而在空载体pEGFP-N1转染组,绿色荧光弥散性分布于细胞核。吕氏泰勒虫TlSP融合基因在外源真核细胞Vero中成功进行了表达,表达蛋白主要定位于Vero细胞的细胞浆。 展开更多
关键词 吕氏泰勒虫 tlsp基因 绿色荧光蛋白 激光共聚焦显微成像技术
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吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达 被引量：3
3
作者 郭鹏飞 韩元 +9 位作者 刘军龙 刘爱红 王锦明 李禤 关贵全 殷宏 罗建勋 刘光远 刘志杰 李有全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期135-141,共7页
为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP（Theileria luwenshuni surface protein）,采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重... 为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP（Theileria luwenshuni surface protein）,采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418（4.0 mg/m L）的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 吕氏泰勒虫 tlsp基因 毕赤酵母 分泌表达 反应原性
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吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析 被引量：4
4
作者 韩元 许强 +10 位作者 杨学财 李有全 郭鹏飞 关贵全 刘军龙 刘爱红 刘光远 李禤 殷宏 罗建勋 蔡葵蒸 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1503-1509,共7页
提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区... 提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 吕氏泰勒虫 tlsp基因 跨膜区 原核表达 反应原性分析
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真核表达的吕氏泰勒虫TlSP重组蛋白的免疫保护效果评价 被引量：2
5
作者 郭鹏飞 韩元 +11 位作者 李禤 刘军龙 刘爱红 贾丹 魏永红 王锦明 关贵全 刘志杰 刘光远 罗建勋 殷宏 李有全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1475-1481,共7页
为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵... 为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵羊的临床症状、红细胞染虫率和特异性抗体效价等来评价免疫保护效果;空白对照组以等量PBS代替抗原进行同步参照分析。结果显示,空白对照组的绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等典型的临床症状,而2个重组蛋白免疫组只出现轻微贫血。空白对照组、免疫A组（600 g）和免疫B组（300 g）分别于攻蜱后第20天、36天和29天最早发现血液中出现泰勒虫,最高染虫率分别为8.60%、1.12%和3.00%,特异性抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。本研究为今后羊泰勒虫病的防治奠定了基础。 展开更多
关键词 吕氏泰勒虫 tlsp 免疫保护效果
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论专门用途英语测试——回顾与展望
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作者 杨咏运 庞超伟 《现代语言学》 2021年第5期1221-1226,共6页
在认同专门用途英语测试应独立存在的基础上,本文系统回顾了国内外关于专门用途英语测试的文献和研究成果,分析并总结了专门用途英语测试的笔试、口试、情景交际测试、任务型测试这四种常用测试方式手段及其主要问题,而后探讨了专门用... 在认同专门用途英语测试应独立存在的基础上,本文系统回顾了国内外关于专门用途英语测试的文献和研究成果,分析并总结了专门用途英语测试的笔试、口试、情景交际测试、任务型测试这四种常用测试方式手段及其主要问题,而后探讨了专门用途英语测试的未来发展趋势。本研究对于ESP测试、教学和研究具有一定参考意义。 展开更多
关键词 ESP 专门用途英语测试 tlsp
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