目的开发靶向转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)且具有跨血脑屏障转运功能的鲨鱼纳米抗体。方法提取未经靶抗原免疫的条纹斑竹鲨外周血单个核细胞总RNA,通过PCR技术扩增获得鲨鱼抗体的重链可变区(variable domain of immunogl...目的开发靶向转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)且具有跨血脑屏障转运功能的鲨鱼纳米抗体。方法提取未经靶抗原免疫的条纹斑竹鲨外周血单个核细胞总RNA,通过PCR技术扩增获得鲨鱼抗体的重链可变区(variable domain of immunoglobulin new antigen receptor,VNAR)基因,将VNAR构建至噬菌体展示载体中,完成鲨鱼纳米抗体天然文库的构建。扩增天然噬菌体展示文库,采用抗原固相淘选策略,通过三轮“结合-洗脱-扩增”的淘选流程完成噬菌体展示文库的富集,通过噬菌体ELISA鉴定阳性克隆,并进行抗体序列比对,以确定靶向TfR1的鲨鱼纳米抗体序列。构建鲨鱼纳米抗体重组表达载体,利用大肠杆菌原核表达系统进行鲨鱼纳米抗体的诱导表达,ELISA检测鲨鱼纳米抗体与TfR1重组蛋白的结合能力,竞争性ELISA检测鲨鱼纳米抗体与转铁蛋白(transferrin,Tf)竞争受体结合表位的情况,免疫荧光技术检测鲨鱼纳米抗体与脑微血管内皮细胞bEnd.3的结合能力,血脑屏障体外实验模型检测鲨鱼纳米抗体的跨血脑屏障转运能力。结果成功构建了库容量为2.35×10^(9) CFU的鲨鱼纳米抗体天然文库,该文库具备良好的多样性。经淘选获得2株靶向TfR1的鲨鱼纳米抗体,均具有亲和活性,其中D1具有跨血脑屏障转运功能。结论本研究成功筛选出靶向TfR1且具有跨血脑屏障转运功能的鲨鱼纳米抗体,为中枢神经系统疾病治疗提供了新的跨血脑屏障药物递送载体。展开更多
文摘目的开发靶向转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR1)且具有跨血脑屏障转运功能的鲨鱼纳米抗体。方法提取未经靶抗原免疫的条纹斑竹鲨外周血单个核细胞总RNA,通过PCR技术扩增获得鲨鱼抗体的重链可变区(variable domain of immunoglobulin new antigen receptor,VNAR)基因,将VNAR构建至噬菌体展示载体中,完成鲨鱼纳米抗体天然文库的构建。扩增天然噬菌体展示文库,采用抗原固相淘选策略,通过三轮“结合-洗脱-扩增”的淘选流程完成噬菌体展示文库的富集,通过噬菌体ELISA鉴定阳性克隆,并进行抗体序列比对,以确定靶向TfR1的鲨鱼纳米抗体序列。构建鲨鱼纳米抗体重组表达载体,利用大肠杆菌原核表达系统进行鲨鱼纳米抗体的诱导表达,ELISA检测鲨鱼纳米抗体与TfR1重组蛋白的结合能力,竞争性ELISA检测鲨鱼纳米抗体与转铁蛋白(transferrin,Tf)竞争受体结合表位的情况,免疫荧光技术检测鲨鱼纳米抗体与脑微血管内皮细胞bEnd.3的结合能力,血脑屏障体外实验模型检测鲨鱼纳米抗体的跨血脑屏障转运能力。结果成功构建了库容量为2.35×10^(9) CFU的鲨鱼纳米抗体天然文库,该文库具备良好的多样性。经淘选获得2株靶向TfR1的鲨鱼纳米抗体,均具有亲和活性,其中D1具有跨血脑屏障转运功能。结论本研究成功筛选出靶向TfR1且具有跨血脑屏障转运功能的鲨鱼纳米抗体,为中枢神经系统疾病治疗提供了新的跨血脑屏障药物递送载体。
