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TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR检测方法的建立和应用 被引量：9
1
作者 陈欣 符芳 +4 位作者 王伟 李雪松 李海忠 宋淑萍 李曦 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期948-951,共4页
为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验... 为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明:重组质粒建立的标准曲线相关系数为99%;可以同时鉴别检测TTV1和TTV2,检测PCV2和PRRSV阳性样品均呈阴性,表明该方法具有良好的特异性;最低检出量为10 copies/μL;重复试验结果显示,TTV1组内和组间变异系数分别为0.14%和0.74%;TTV2组内和组间变异系数均为0.13%;检测现地采集的189份样品,TTV1阳性率32.3%,TTV2阳性率6.3%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率28.6%。TTV检测方法的建立为猪群TTV病的流行病学调查提供了有效的手段。 展开更多
关键词 SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR TTV1 ttv2
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猪TTV2 ORF1基因的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：2
2
作者 张文文 王小敏 +14 位作者 肖琦 周忠涛 汪伟 温立斌 李彬 郭容利 张雪寒 周俊明 倪艳秀 吕立新 俞正玉 茅爱华 胡屹屹 刘永杰 何孔旺 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期119-124,共6页
为了构建猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因部分片段的原核表达载体,进行原核表达,并利用重组蛋白质制备猪TTV2的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出猪TTV2 ORF1基因的部分片段,将其克隆至原核表达载体pcoldI中,构建原核表达质粒pcold-g1,然... 为了构建猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因部分片段的原核表达载体,进行原核表达,并利用重组蛋白质制备猪TTV2的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出猪TTV2 ORF1基因的部分片段,将其克隆至原核表达载体pcoldI中,构建原核表达质粒pcold-g1,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。表达产物通过镍离子亲和层析柱进行纯化,用Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白质免疫新西兰大白兔制备猪TTV2多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。PCR扩增获得大小为1 227 bp的片段,重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;重组蛋白质分子量为5.2×104,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度可达95%以上,具有较好的抗原性;制备的多克隆抗体特异性高,抗体效价达1∶12 800。重组蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达,为建立TTV2间接ELISA检测方法提供了优质的包被抗原。 展开更多
关键词 猪ttv2 ORF1基因 原核表达 多克隆抗体
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我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析 被引量：47
3
作者 王礞礞 周艳君 +6 位作者 陈宗艳 于海 李国新 阎丽萍 姜一峰 侯军委 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期751-755,共5页
为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%。两者的混合... 为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%。两者的混合感染率为38.4%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分非编码区(UTR)片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2病毒UTR序列进行比较分析,同时我们选择了8份阳性样品进行了TTV1和TTV2的全长基因的扩增和克隆。分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其中我们分离获得的TTV1和TTV2之间的UTR核苷酸同源性分别为80.8%～98.5%和94.2%～100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%～100%和95.5%～99.1%。本研究首次证实在我国猪群中存在TTV感染,提示我们对猪群感染的TTV是一个不容忽视的新病原。 展开更多
关键词 TTV UTR基因 TTV1 ttv2
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中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染 被引量：9
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作者 温立斌 何孔旺 +11 位作者 杨汉春 郭容利 李成仁 钟书霖 茅爱华 倪艳秀 张雪寒 周俊明 吕立新 俞正玉 李彬 王小敏 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期85-90,共6页
为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，... 为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，TTV2的为34．8％，共感染率为5．8％。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87．3％～93．8％和74．8％～99．1％，与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69．6％～100．0％和74．8％～99．1％。系统进化分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。 展开更多
关键词 TTV1 ttv2 5’UTR 猪 中国
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中国西南地区猪群中TTV分子流行病学调查 被引量：5
5
作者 伍志伟 王红宁 +2 位作者 杨鑫 管仲斌 周英顺 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期779-782,共4页
为了解西南地区猪群中Torque teno virus(TTV)感染流行情况,以TTV 5′非编码区(5′UTR)保守序列设计引物,建立了猪TTV检测的巢式PCR(nPCR)方法,并对该地区22个规模化养猪场363份血清进行了检测。结果表明,在被检血清样品中TTV1和TTV2感... 为了解西南地区猪群中Torque teno virus(TTV)感染流行情况,以TTV 5′非编码区(5′UTR)保守序列设计引物,建立了猪TTV检测的巢式PCR(nPCR)方法,并对该地区22个规模化养猪场363份血清进行了检测。结果表明,在被检血清样品中TTV1和TTV2感染率为79.6%、87.1%,两者的混合感染率为68.3%。证实TTV在西南地区猪群中广泛存在,提示人们应当重视防止TTV感染的进一步流行。 展开更多
关键词 TORQUE teno VIRUS TTV1 ttv2 nPCR 流行病学调查
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山东省猪群TTV感染情况及分子流行病学分析 被引量：6
6
作者 李俊 时建立 +5 位作者 刘洋 吴家强 丛晓燕 徐绍建 孙文博 王金宝 《中国动物检疫》 CAS 2011年第1期65-68,共4页
为了确定Torque teno virus(TTV)在山东省猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法检测了来自山东省不同地区10个猪场的230份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为45.2%和85.7%。两者的混合感染率... 为了确定Torque teno virus(TTV)在山东省猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法检测了来自山东省不同地区10个猪场的230份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为45.2%和85.7%。两者的混合感染率为39.3%。用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分片段,并将扩增出的部分基因与已报道的TTV1和TTV2病毒序列进行比较分析。分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其TTV1和TTV2与参考株相比同源性分别为88.0%～92.8%和91.9%～94.1%。本研究证实在山东省猪群中存在TTV感染,由于TTV可以感染人,其在公共卫生学方面的意义应当引起我们的重视。 展开更多
关键词 TTV TTV1 ttv2
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猪源TTV Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用 被引量：5
7
作者 侯军委 周艳君 +3 位作者 王礞礞 李国新 于海 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 2011年第2期13-19,共7页
根据TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳... 根据TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品分别绘制标准曲线,TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。检测结果显示,两种方法的灵敏度均可达10 copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。检测采集自广西和内蒙古的44份病料,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。 展开更多
关键词 TTV1 ttv2 Taqman实时荧光定量PCR
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猪输血传播病毒2型ORF1基因的原核表达及条件优化 被引量：1
8
作者 王小敏 何孔旺 +7 位作者 张文文 王东田 周忠涛 张雪寒 周俊明 汪伟 倪艳秀 温立斌 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期38-43,共6页
为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到... 为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到原核表达载体pcoldI上,构建表达载体pcold-ORF1,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF1融合蛋白。并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定了pcold-ORF1重组蛋白表达的最佳表达条件。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白在BL21中高效表达,以包涵体形式表达为主,分子质量约为39 kDa。蛋白表达量随诱导时间增加而有所增加,在15℃时表达量最高,而IPTG浓度对蛋白的表达量没有显著影响。Western Blotting结果表明,重组蛋白与猪TTV2阳性血清特异性反应,具有很好的免疫原性。成功获得TTV2-ORF1基因,构建了原核表达载体并获得高效表达,为TTV的ELISA检测方法的建立提供抗原。且重组蛋白在15℃条件下,加入0.2 mmol/L浓度的IPTG,诱导24 h,表达条件最佳。 展开更多
关键词 猪输血传播病毒2型 基因克隆 原核表达
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TT病毒ORF_2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位
9
作者 何燕 叶林柏 +5 位作者 李礼 廖庆姣 特马力 佘应龙 叶力 吴正辉 《中国病毒学》 CSCD 2004年第5期431-434,F002,共5页
应用PCR方法从含有TTVirusORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白。构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定。用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染... 应用PCR方法从含有TTVirusORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1中以表达成GFP-VP2融合蛋白。构建出的重组质粒pEGFPTTV2经过酶切分析和PCR鉴定。用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物。用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究TTVVP2蛋白在细胞中的分布情况。结果表明,TTVVP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧。因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录。 展开更多
关键词 输血传播病毒(TTV)ORF2 GFP VP2 PI 蛋白质定位
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