【目的】探究猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)感染对先天性免疫的影响及免疫信号传导的干扰机制,重点解析信号传导转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)与三方基序蛋白21(tripar...【目的】探究猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)感染对先天性免疫的影响及免疫信号传导的干扰机制,重点解析信号传导转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)与三方基序蛋白21(tripartite-motif protein 21,TRIM21)在此过程中的作用。【方法】通过倒置显微镜观察感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的PDCoV感染IPEC-J2细胞1、12、24、48 h后细胞形态学变化,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测PDCoV-N基因及蛋白的表达水平,以此筛选PDCoV感染IPEC-J2细胞模型的最佳条件。在PDCoV感染峰值时,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测STAT1、TRIM21及干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的mRNA和蛋白表达水平;通过双荧光素酶报告基因系统检测过表达或抑制STAT1对PDCoV复制及干扰素激活反应元件(interferon-stimulated response element,ISRE)启动子活性的影响;将TRIM21与STAT1真核表达载体共转染至IPEC-J2细胞,结合激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀技术(coimmunoprecipitation,Co-IP)和Western blotting验证二者的相互作用及TRIM21对STAT1的调控效应。【结果】PDCoV在感染IPEC-J2细胞24 h达复制高峰,同时试验组细胞中STAT1、TRIM21蛋白表达及ISGs转录水平均极显著高于对照组(P<0.01)。与对照组相比,过表达STAT1后ISRE启动子活性极显著增强,PDCoV-N基因及其蛋白表达量极显著降低(P<0.01),而氟达拉滨抑制STAT1后则极显著促进病毒复制(P<0.01)。激光共聚焦显微镜观察与Co-IP结果显示,STAT1与TRIM21存在共定位及相互作用,且与对照组相比,过表达TRIM21后STAT1蛋白表达量极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究解析了PDCoV与宿主IPEC-J2细胞先天性免疫的相互作用机制,STAT1作为关键抗病毒因子通过ISRE通路增强先天性免疫来抑制病毒复制,TRIM21则靶向STAT1并下调其表达从而帮助病毒免疫逃逸。研究结果不仅为深入理解PDCoV的致病分子机制提供了新见解,也为制定PDCoV防控策略奠定了基础。展开更多
文摘【目的】探究猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)感染对先天性免疫的影响及免疫信号传导的干扰机制,重点解析信号传导转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)与三方基序蛋白21(tripartite-motif protein 21,TRIM21)在此过程中的作用。【方法】通过倒置显微镜观察感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1的PDCoV感染IPEC-J2细胞1、12、24、48 h后细胞形态学变化,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测PDCoV-N基因及蛋白的表达水平,以此筛选PDCoV感染IPEC-J2细胞模型的最佳条件。在PDCoV感染峰值时,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测STAT1、TRIM21及干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的mRNA和蛋白表达水平;通过双荧光素酶报告基因系统检测过表达或抑制STAT1对PDCoV复制及干扰素激活反应元件(interferon-stimulated response element,ISRE)启动子活性的影响;将TRIM21与STAT1真核表达载体共转染至IPEC-J2细胞,结合激光共聚焦显微镜、免疫共沉淀技术(coimmunoprecipitation,Co-IP)和Western blotting验证二者的相互作用及TRIM21对STAT1的调控效应。【结果】PDCoV在感染IPEC-J2细胞24 h达复制高峰,同时试验组细胞中STAT1、TRIM21蛋白表达及ISGs转录水平均极显著高于对照组(P<0.01)。与对照组相比,过表达STAT1后ISRE启动子活性极显著增强,PDCoV-N基因及其蛋白表达量极显著降低(P<0.01),而氟达拉滨抑制STAT1后则极显著促进病毒复制(P<0.01)。激光共聚焦显微镜观察与Co-IP结果显示,STAT1与TRIM21存在共定位及相互作用,且与对照组相比,过表达TRIM21后STAT1蛋白表达量极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究解析了PDCoV与宿主IPEC-J2细胞先天性免疫的相互作用机制,STAT1作为关键抗病毒因子通过ISRE通路增强先天性免疫来抑制病毒复制,TRIM21则靶向STAT1并下调其表达从而帮助病毒免疫逃逸。研究结果不仅为深入理解PDCoV的致病分子机制提供了新见解,也为制定PDCoV防控策略奠定了基础。
