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TPCK胰酶对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上增殖的影响
1
作者 张大妹 杨柳 +5 位作者 高广亮 李绍梅 罗杰 付利芝 余远迪 许国洋 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第5期919-925,共7页
旨在探究甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮(TPCK)胰酶对猪流行性腹泻病毒(PEDV)在Vero细胞上增殖规律的影响。试验通过在病毒增殖过程添加TPCK胰酶和常规胰酶,利用RT-qPCR技术,分析病毒吸附和入侵Vero细胞的变化规律,并通过生长曲线绘制、... 旨在探究甲苯磺酰基-L-氨基联苯氯甲基酮(TPCK)胰酶对猪流行性腹泻病毒(PEDV)在Vero细胞上增殖规律的影响。试验通过在病毒增殖过程添加TPCK胰酶和常规胰酶,利用RT-qPCR技术,分析病毒吸附和入侵Vero细胞的变化规律,并通过生长曲线绘制、IFA鉴定和细胞活性检测,解析PEDV在Vero细胞上的复制能力变化。结果显示,TPCK胰酶和常规胰酶最适质量浓度分别为1、6 mg/L;PEDV含量随着TPCK胰酶和常规胰酶前处理时间延长呈下降趋势;在病毒增殖过程中添加不同胰酶对PEDV入侵Vero细胞无促进作用,在入侵4 h后,各组病毒粒子均逐渐增加;通过生长曲线绘制,发现TPCK胰酶组在24 h时病毒含量达到最高(lg TCID_(50)=(6.30±0.14)/0.1 mL),且此时产生的荧光强度高于常规胰酶组,36 h时病毒含量呈下降趋势。结果表明,TPCK胰酶对PEDV在Vero细胞上的增殖有更好的促进作用,为TPCK胰酶影响PEDV增殖作用机制进一步研究提供了理论依据,也为PEDV流行毒株的分离纯化提供了数据支撑。 展开更多
关键词 TPCK胰酶 猪流行性腹泻病毒 VERO细胞 增殖 入侵
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重组胰蛋白酶和TPCK胰蛋白酶用于曲妥珠单抗肽图分析的对比研究
2
作者 刘巧 刘晓 +2 位作者 温学美 李素霞 潘红娟 《中国医药工业杂志》 2025年第10期1282-1292,共11页
该研究采用曲妥珠单抗作为肽图分析样本,从常规酶量快速酶切、低酶量过夜酶切和酶活测定3个方面,综合对比了重组胰蛋白酶和N-(对甲苯磺酰基)-L-苯丙氨酰甲基氯酮(TPCK)处理胰蛋白酶的性能。结果显示,单抗经2种胰蛋白酶处理后轻链覆盖度... 该研究采用曲妥珠单抗作为肽图分析样本,从常规酶量快速酶切、低酶量过夜酶切和酶活测定3个方面,综合对比了重组胰蛋白酶和N-(对甲苯磺酰基)-L-苯丙氨酰甲基氯酮(TPCK)处理胰蛋白酶的性能。结果显示,单抗经2种胰蛋白酶处理后轻链覆盖度均为100%;而经重组胰蛋白酶处理后,重链的序列覆盖度优于TPCK胰蛋白酶处理组。快速酶切结果显示,相较TPCK胰蛋白酶,尽管重组胰蛋白酶的漏切和非特异性酶切相对丰度更高,但在短时间内对单抗的酶切更完全。低酶量过夜酶切结果显示,重组胰蛋白酶处理的单抗漏切和非特异性酶切相对丰度低于TPCK胰蛋白酶处理组。此外,TPCK胰蛋白酶的酶切结果含有糜蛋白酶水解位点(F,苯丙氨酸)。进一步酶活测定试验结果表明,重组胰蛋白酶的活性和稳定性优于TPCK胰蛋白酶。综上所述,2种胰蛋白酶都可用于常规用量和酶切时间的肽图分析,但重组胰蛋白酶具备更好的活性、酶切特异性和稳定性,是生物制品肽图分析和其他结构表征前处理的更优选择。 展开更多
关键词 重组胰蛋白酶 TPCK胰蛋白酶 曲妥珠单抗 肽图分析 快速酶切 过夜酶切 酶活
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维持培养基组分对流感病毒增殖效果的影响
3
作者 黄世腾 杨瑞军 吕磊 《中国公共卫生管理》 2018年第5期613-616,共4页
目的探究维持培养基不同组分对流感病毒增殖的影响,提高病毒增殖效率。方法通过改变维持培养基的组分,分别添加不同浓度的TPCK-胰酶、谷氨酰胺、葡萄糖和丁酸钠,用其对流感病毒在MDCK细胞中进行增殖培养,在24h、48h、72h、96h对培养物... 目的探究维持培养基不同组分对流感病毒增殖的影响,提高病毒增殖效率。方法通过改变维持培养基的组分,分别添加不同浓度的TPCK-胰酶、谷氨酰胺、葡萄糖和丁酸钠,用其对流感病毒在MDCK细胞中进行增殖培养,在24h、48h、72h、96h对培养物进行血凝素(HA)滴度测定;同时检测不同浓度的丁酸纳对MDCK细胞活性的影响。结果流感病毒新甲型H1N1、A(H3N2)和B(Victoria)增殖的最佳胰酶浓度为3μg/m L,B(Yamagata)最佳胰酶浓度为2μg/m L;各亚型流感病毒增殖的最适宜谷氨酰胺浓度为4mM;最适宜葡萄糖浓度为(20～30) m M;最佳丁酸钠浓度为0. 5mM,过高的丁酸钠浓度对流感病毒增殖有抑制作用,丁酸钠降低细胞活性的能力随浓度提高而增加。结论调节维持培养基组分浓度能够提高流感病毒的增殖效率,为高效地进行流感病毒分离和流感疫苗生产提供基础数据。 展开更多
关键词 流感病毒 病毒增殖 MDCK细胞 TPCK-胰酶 丁酸钠
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HPLC分析胸腺法新的肽图 被引量：1
4
作者 田妮娜 封士兰 周丽 《华西药学杂志》 CAS CSCD 2016年第1期63-65,共3页
目的用HPLC分析胸腺法新的肽图。方法用TPCK-胰蛋白酶裂解和RP-HPLC法测定胸腺法新的肽图,用ESILC/MS技术分析肽段的精确相对分子量。结果根据肽段的色谱保留时间,相对分子质量归属肽图中肽段所在的色谱峰。结论所用方法精密度高、重复... 目的用HPLC分析胸腺法新的肽图。方法用TPCK-胰蛋白酶裂解和RP-HPLC法测定胸腺法新的肽图,用ESILC/MS技术分析肽段的精确相对分子量。结果根据肽段的色谱保留时间,相对分子质量归属肽图中肽段所在的色谱峰。结论所用方法精密度高、重复性好,可为胸腺法新的质量分析和控制提供依据。 展开更多
关键词 胸腺法新 肽图分析 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法 液质联用 相对分子量
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测序级胰蛋白酶的制备工艺与质量检测 被引量：8
5
作者 喻峰 卢大儒 陈薇 《生物技术通讯》 CAS 2014年第1期76-81,共6页
目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,... 目的:制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法:取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解,采用高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥;甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)修饰,以抑制糜蛋白酶等非特异性酶切活性,并经反相色谱柱再纯化,获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶;自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE、HPLC反相色谱分析、酶比活力测定,并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列等,检测其纯度、酶水解效率及酶切位点特异性。结果:自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200 U/mgP(TAME)以上,质谱分析酶切特异性好;且酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的生产与开发中。结论:制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定、HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。 展开更多
关键词 胰蛋白酶 还原甲基化 TPCK修饰 高效液相色谱 反相色谱纯化 质谱分析
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悬浮MDCK细胞培养H7N9流感病毒时TPCK胰酶添加量的优化研究
6
作者 孟子延 张家友 +7 位作者 刘琛 张哲罡 邱冉 罗丹 施金荣 赵巍 夏志武 杨晓明 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期835-839,共5页
目的探讨在悬浮MDCK细胞中培养H7N9禽流感病毒时最佳的TPCK胰酶添加量。方法在细胞生长期和产毒期,添加不同浓度的TPCK胰酶,每12 h取样监测其对细胞生长的数量、活率、葡萄糖和乳酸的代谢以及血凝滴度的影响,并对TPCK胰酶的批间差异做... 目的探讨在悬浮MDCK细胞中培养H7N9禽流感病毒时最佳的TPCK胰酶添加量。方法在细胞生长期和产毒期,添加不同浓度的TPCK胰酶,每12 h取样监测其对细胞生长的数量、活率、葡萄糖和乳酸的代谢以及血凝滴度的影响,并对TPCK胰酶的批间差异做一探索。细胞生长期胰酶的添加量为0、1、2、4、6、8、10、15μg/ml;产毒期胰酶的添加量为0、0.5、1、1.5、2、2.5μg/ml。出现血凝滴度同等情况时,以MOI为0.001、0.005、0.025、0.05再次进行优化。结果未见TPCK胰酶浓度对细胞数量、活率、葡萄糖和乳酸代谢明显的线性影响;在TPCK胰酶浓度高达15μg/ml时,也未见其对细胞生长的毒性。接种H7N9禽流感病毒后,1、1.5、2、2.5μg/ml的胰酶添加在48 h都达到了最高的滴度,为1∶26.5,在60 h,后两种添加浓度的血凝滴度下降快于前两种添加浓度;MOI为0.005时,1.5μg/ml的胰酶添加在48 h产生的血凝滴度26.5高于同等条件下1μg/ml的26的血凝滴度。在TPCK胰酶不同批次中,有批间差异的存在。结论1μg/ml和1.5μg/ml的胰酶添加可更好地促进H7N9禽流感病毒增殖,但1.5μg/ml的添加有更广谱的MOI适用性。 展开更多
关键词 MDCK细胞 H7N9 禽流感病毒 TPCK胰酶 优化研究
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