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TP53BP2/ASPP2通过p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬 被引量:5
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作者 许萍 时红林 +2 位作者 焦彦 陈德喜 时红波 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期986-991,共6页
目的研究肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(TP53BP2/ASPP2)对HepG2人肝癌细胞自噬的调节作用和机制。方法通过腺病毒、慢病毒感染HepG2细胞上调或下调细胞中ASPP2的表达,HepG2细胞继续在不含胎牛血清的培养基中培养24 h,通过Weste... 目的研究肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(TP53BP2/ASPP2)对HepG2人肝癌细胞自噬的调节作用和机制。方法通过腺病毒、慢病毒感染HepG2细胞上调或下调细胞中ASPP2的表达,HepG2细胞继续在不含胎牛血清的培养基中培养24 h,通过Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin1、P62、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白mTOR、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、真核转录起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)、核糖体蛋白S6、磷酸化的S6(p-S6)、核糖体S6激酶B1(RPS6KB1/p70S6K)、磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)的蛋白表达,荧光显微镜检测细胞表达的绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(GFP-LC3)融合蛋白。同时,使用慢病毒感染不表达p53的Hep3B细胞,敲低细胞中的ASPP2水平,Western blot法检测Hep3B细胞ASPP2和mTOR通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、S6、p-S6、RPS6KB1/p70S6K、p-p70S6K的蛋白表达。结果当ASPP2的表达上调时,mTOR复合物1(mTORC1)通路被激活,并且自噬相关蛋白的表达和自噬体的数量减少。在下调ASPP2表达后,mTORC1通路受到抑制,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体的数量增加。在p53表达沉默的Hep3B细胞中,当ASPP2下调后,mTORC1途径仍然受到抑制。结论ASPP2以p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬。 展开更多
关键词 自噬 肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(tp53bp2/ASPP2) 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) P53
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TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定
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作者 李全维 高明慧 +3 位作者 寇卜心 柴梦音 石英 刘晓霓 《现代检验医学杂志》 CAS 2024年第6期11-17,共7页
目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基... 目的构建人肿瘤抑制因子p53结合蛋白2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法利用UniProt网站查询TP53BP2基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2Ae GFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2重组蛋白表达水平。通过His标签纯化试剂盒及Superdex 20010/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白结合情况。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2蛋白与p65蛋白共定位。利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功。Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用。IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2蛋白具有生物学活性。结论成功构建了TP53BP2基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 肿瘤抑制因子p53结合蛋白2 人全长肿瘤抑制因子P53结合蛋白2真核表达 人胚肾细胞Expi293 瞬时转染 蛋白纯化 活性鉴定
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TP53BP2:Roles in suppressing tumorigenesis and therapeutic opportunities 被引量:4
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作者 Yunfei Huo Ke Cao +5 位作者 Buxin Kou Mengyin Chai Shuangshuang Dou Dexi Chen Ying Shi Xiaoni Liu 《Genes & Diseases》 SCIE CSCD 2023年第5期1982-1993,共12页
Malignant tumor is still a major problem worldwide.During tumorigenesis or tumor development,tumor suppressor p53-binding protein 2(TP53BP2),also known as apoptosis stimulating protein 2 of p53(ASPP2),plays a critical... Malignant tumor is still a major problem worldwide.During tumorigenesis or tumor development,tumor suppressor p53-binding protein 2(TP53BP2),also known as apoptosis stimulating protein 2 of p53(ASPP2),plays a critical role in p53 dependent and independent manner.Expression of TP53BP2 is highly correlated with the prognosis and survival rate of malignant tumor patients.TP53BP2 can interact with p53,NF-κB p65,Bcl-2,HCV core protein,PP1,YAP,CagA,RAS,PAR3,and other proteins to regulate cell function.Moreover,TP53BP2 can also regulate the proliferation,apoptosis,autophagy,migration,EMT and drug resistance of tumor cells through downstream signaling pathways,such as NF-κB,RAS/MAPK,mevalonate,TGF-β1,PI3K/AKT,aPKC-ι/GLI1 and autophagy pathways.As a potential therapeutic target,TP53BP2 has been attracted more attention.We review the role of TP53BP2 in tumorigenesis or tumor development and the signal pathway involved in TP53BP2,which may provide more deep insight and strategies for tumor treatment. 展开更多
关键词 Binding proteins Signaling pathways TP53 tp53bp2 TUMORIGENESIS Tumor development
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