白喉毒素突变体蛋白(cross-reacting material 197, CRM197)是一种常用的多糖结合疫苗载体,其在大肠杆菌体系中往往以包涵体形式表达。为了改善通过包涵体复性来制备CRM197而导致的收率低、操作烦琐等不足,研究设计了一种基于SUMO标签...白喉毒素突变体蛋白(cross-reacting material 197, CRM197)是一种常用的多糖结合疫苗载体,其在大肠杆菌体系中往往以包涵体形式表达。为了改善通过包涵体复性来制备CRM197而导致的收率低、操作烦琐等不足,研究设计了一种基于SUMO标签串联的策略,改善重组CRM197的可溶性,同时使用Origami B (DE3)大肠杆菌宿主,成功使重组CRM197蛋白上清液可溶比例提高至95%以上。同时简化了CRM197蛋白的获取途径,经两步Ni亲和层析和一步酶切除去融合标签等手段建立了从破菌上清液中纯化CRM197的方法,获得纯度高于98%的CRM197且收率大于80%。通过圆二色光谱及荧光发射光谱分析等证实纯化所得CRM197空间结构折叠正确。抗原性ELISA实验结果表明所制得的CRM197蛋白与CRM197标准品蛋白抗原性相当。研究结果表明串联双SUMO标签对重组CRM197在大肠杆菌中高效、可溶表达具有促进作用,并建立了快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性的CRM197蛋白,为改善重组蛋白在原核表达体系的可溶表达设计提供了新思路。展开更多
目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDN...目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;将质粒pXJ40-myc-PRB分别与pcDNA3-FLAG、pcDNA3FLAG-SUMO2、pcDNA3FLAG-SUMO3共转染人胚肾细胞293T,运用免疫共沉淀及western印迹的方法检测其是否发生类泛素化修饰;运用测定荧光素酶报告基因的方法检测类泛素化修饰对孕激素受体转录活性的影响。结果构建成功表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;免疫共沉淀实验证实sumo2/3均可以与PRB共价结合;SUMO-2、SUMO-3能以孕激素依赖的方式增强PRB的转录活性。结论 SUMO-2、SUMO-3分子能够对孕激素受体PRB进行类泛素化修饰,并调节其分子功能。展开更多
文摘白喉毒素突变体蛋白(cross-reacting material 197, CRM197)是一种常用的多糖结合疫苗载体,其在大肠杆菌体系中往往以包涵体形式表达。为了改善通过包涵体复性来制备CRM197而导致的收率低、操作烦琐等不足,研究设计了一种基于SUMO标签串联的策略,改善重组CRM197的可溶性,同时使用Origami B (DE3)大肠杆菌宿主,成功使重组CRM197蛋白上清液可溶比例提高至95%以上。同时简化了CRM197蛋白的获取途径,经两步Ni亲和层析和一步酶切除去融合标签等手段建立了从破菌上清液中纯化CRM197的方法,获得纯度高于98%的CRM197且收率大于80%。通过圆二色光谱及荧光发射光谱分析等证实纯化所得CRM197空间结构折叠正确。抗原性ELISA实验结果表明所制得的CRM197蛋白与CRM197标准品蛋白抗原性相当。研究结果表明串联双SUMO标签对重组CRM197在大肠杆菌中高效、可溶表达具有促进作用,并建立了快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性的CRM197蛋白,为改善重组蛋白在原核表达体系的可溶表达设计提供了新思路。
文摘核转录因子(nuclear factorκb,NF-κB)是公认的炎症和免疫反应的调节因子,与糖尿病肾病的发生发展密切相关。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,sumo)参与了NF-κB信号通路的调控,NF-κB抑制蛋白(inhibitor ofnf-κB,IκB)等NF-κB通路中重要的蛋白因子均可被小泛素相关修饰物修饰,进而调控NF-κB信号通路。sumo化修饰酶在该调控中发挥极其重要的作用,其中sumo结合酶E2(即ubc9蛋白)和sumo连接酶E3成员之一的信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)抑制蛋白(protein inhibitor of activated STAT,PIAS)家族是近年来的研究热点。文中综述sumo化、sumo化修饰酶及其对糖尿病肾病NF-κb信号通路的调控作用。
