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表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定
1
作者 史家宝 蒙靓 +4 位作者 肖培宇 范峻豪 安同庆 王海伟 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期140-146,共7页
为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测... 为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb)5D10(1∶1000)、鼠源Strep-tag II MAb(1∶2000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G(1∶2000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光,表明拯救了Strep-tag II标记的重组病毒,并将其命名为r SVA-Strep。将r SVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代,每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定r SVA-Strep的遗传稳定性。结果显示,每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带,第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag II基因仍在重组病毒中,且无基因突变,表明r SVA-Strep的遗传稳定性较强;将SVA-WT和r SVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞,在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线,结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致,表明Strep-tag II的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活r SVA-Strep,并利用Strep-TactinRXT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒,将r SVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱,分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果。对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示,不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带,且E1和E2的条带最明显,表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV;以上结果表明r SVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化。本研究在SVA中插入Strep-tag II标签,为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段,也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 strep-tag II 感染性克隆 抗原纯化
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表达Strep-tag的重组H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立
2
作者 周圆一 王正祥 +2 位作者 汪亮 徐帅 曾巧英 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第2期15-21,共7页
为构建携带Strep标签的禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)A/Goose/Hunan/109/2014(H5N6,HN109)反向遗传操作系统,RT-PCR扩增AIV HN109株8个基因片段,分别连接至p BD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77~84位的氨基酸... 为构建携带Strep标签的禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)A/Goose/Hunan/109/2014(H5N6,HN109)反向遗传操作系统,RT-PCR扩增AIV HN109株8个基因片段,分别连接至p BD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77~84位的氨基酸替换成Strep-tag。将8个重组质粒共转染293T细胞,48 h后收取细胞上清接种至9~11日龄SPF鸡胚,并检测血凝效价。结果显示,本研究成功拯救病毒株r HN109-NS1-Strep。r HN109-NS1-Strep的8个基因片段序列与亲本毒素HN109株一致;r HN109-NS1-Strep与亲本毒HN109株在MDCK细胞上复制水平相似,在小鼠体内病毒复制能力相似。结果表明,本研究已成功构建携带Strep-tag的H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为研究该病毒的分子致病机理、传播机制及新型疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5N6亚型 strep-tag
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N末端Strep蛋白标签表达载体的构建和应用 被引量：2
3
作者 石禹 吉宏张 包小峰 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期98-102,共5页
目的构建携带N末端Strep(NS)蛋白标签的表达载体;在表达载体中构建衣原体RNA聚合酶亚基重组蛋白并表达。方法采用PCR的方法,通过引物引入NS蛋白标签和新的多克隆位点替代p ET21c-DH质粒中原有的T7蛋白标签和多克隆位点,选择新引入的Not ... 目的构建携带N末端Strep(NS)蛋白标签的表达载体;在表达载体中构建衣原体RNA聚合酶亚基重组蛋白并表达。方法采用PCR的方法,通过引物引入NS蛋白标签和新的多克隆位点替代p ET21c-DH质粒中原有的T7蛋白标签和多克隆位点,选择新引入的Not I酶切位点进行PCR产物的环化自连,转化DH-5α细菌后筛选阳性菌株,PCR法和基因测序法鉴定新构建的表达载体;在新构建表达载体的Bam H I和Sal I位点之间分别插入衣原体RNA聚合酶核心酶的α、β、β'亚基,获得表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,转化表达菌株Arctic Express,筛选阳性表达菌株,并用考马斯亮蓝染色、Western blot等法鉴定融合蛋白的表达情况。结果成功构建了携带NS蛋白标签的p ET21c-NSMCS载体,并成功将其应用于衣原体RNA聚合酶核心酶亚基融合蛋白的构建及表达。结论获得稳定表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,为研究衣原体基因转录调控奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 Strep蛋白标签 表达载体 融合蛋白 克隆 RNA聚合酶 衣原体
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