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Construction of a Plasmid and a Standard Curve for Real-time Quantitative PCR of the Cold-induced Cor3 Gene from Volvariella volvacea 被引量：4
1
作者 WANG Hong CHEN Mingjie 《食用菌学报》 2007年第3期20-23,共4页
关键词 草菇 质粒 pcr Cor3基因 冷诱导 标准曲线
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即食果蔬制品中致泻大肠埃希氏菌检测微滴数字PCR系统的建立 被引量：1
2
作者 张雪 马丽侠 +4 位作者 叶德萍 易艳 姜展樾 周李华 谢贞建 《食品工业科技》 北大核心 2025年第21期357-365,共9页
传统的致泻大肠埃希氏菌检验方法耗时较长,为缩短检测时间,构建了含致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp特征基因的质粒DNA标准物质候选物,针对bfpB、ipaH、stp基因建立一套可实现快速检测的微滴式数字PCR系统。用微滴数字PCR(Droplet Digi... 传统的致泻大肠埃希氏菌检验方法耗时较长,为缩短检测时间,构建了含致泻大肠埃希氏菌bfpB、ipaH、stp特征基因的质粒DNA标准物质候选物,针对bfpB、ipaH、stp基因建立一套可实现快速检测的微滴式数字PCR系统。用微滴数字PCR(Droplet Digital PCR,ddPCR)进行引物探针浓度和退火温度等体系优化后,以梯度稀释的质粒DNA为模板评估方法的线性相关性和精密度,添加非目标基因invE、sth为模板验证方法特异性,并将构建的ddPCR方法用于即食果蔬制品的实际检测。结果表明,bfpB、ipaH、stp质粒DNA最优引物终浓度均为400 nmol/L,最优探针终浓度分别为200、100、200 nmol/L;bfpB、ipaH、stp质粒DNA最优退火温度分别为60、58、58℃;特征基因bfpB、ipaH、stp分别在8.87~38700.00、3.33~36533.33、6.57~61833.33 copies/μL浓度范围呈线性相关,浓度梯度的线性相关系数r值均大于0.99;bfpB、ipaH、stp基因的定量限分别为15.33、7.97、15.00 copies/μL,检出限分别为8.87、3.33、6.57 copies/μL;方法精密度小于5%,特异性良好;实际样品检测结果显示,未加标样品未检出,而加标样品及阳性对照均可检出,ddPCR方法检测结果与国标方法检测结果一致。建立的方法可大大缩短致泻大肠埃希氏菌的检测时间,为食品中致泻大肠埃希氏菌的快速检测提供技术参考。 展开更多
关键词 致泻大肠埃希氏菌 毒力因子 微滴式数字pcr 质粒DNA标准物质候选物
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对五种qPCR和PCR方法在弓形虫诊断中的比较研究
3
作者 黄艳丽 陈亚娜 +5 位作者 白邵缘 周国庆 崔灿 李宇渊 黄思扬 原霖 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第3期346-353,共8页
为了评估国内外4个标准中涉及的5个PCR和实时定量PCR(qPCR)方法在弓形虫病诊断中的性能,本研究基于弓形虫速殖子评估了各检测方法的敏感性、重复性和特异性,并通过检测62份猫粪便样品对上述诊断方法进行了比较分析。结果显示,所有标准... 为了评估国内外4个标准中涉及的5个PCR和实时定量PCR(qPCR)方法在弓形虫病诊断中的性能,本研究基于弓形虫速殖子评估了各检测方法的敏感性、重复性和特异性,并通过检测62份猫粪便样品对上述诊断方法进行了比较分析。结果显示,所有标准方法都有较好的特异性和重复性,其中检验检疫标准中的qPCR方法、WOAH标准的qPCR方法和农业标准的PCR方法最低检测限最小(速殖子的浓度约为每微升0.375个),其次是国家标准的PCR方法(速殖子的浓度约为每微升3.75个),检验检疫标准的PCR方法敏感性最低(速殖子的浓度约为每微升375个)。对62份猫粪便样品进行检测分析发现,敏感性最高(99.23%)的方法为检验检疫标准的qPCR方法,特异性最高(99.13%)的是国家标准的PCR方法,敏感性最低(91.73%)的是检验检疫标准中的PCR方法,特异性最低(96.82%)的是农业标准的PCR方法。本研究为弓形虫病诊断标准方法的选择提供了参考。 展开更多
关键词 弓形虫 标准 pcr qpcr 方法评价
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实时荧光定量PCR仪校准实证分析
4
作者 孙世雄 靳继惠 +5 位作者 焉鑫 黄孟锟 孙翔翔 张培培 王毓秀 樊晓旭 《中国动物检疫》 2025年第10期115-119,共5页
定期对实时荧光定量PCR仪校准,对于确保试验结果准确、可靠有重要意义。为确保实时荧光定量PCR仪性能良好,对其执行温度和光学系统校准。首先利用温度传感器对温度的示值误差、均匀度和平均升/降温速率进行分析,然后利用标准物质对样品... 定期对实时荧光定量PCR仪校准,对于确保试验结果准确、可靠有重要意义。为确保实时荧光定量PCR仪性能良好,对其执行温度和光学系统校准。首先利用温度传感器对温度的示值误差、均匀度和平均升/降温速率进行分析,然后利用标准物质对样品的示值误差和线性相关系数进行分析。结果显示:当设定温度≥70℃时,示值误差未超出±0.5℃范围;当设定温度≥60℃时,均匀度≤1.0℃;平均升/降温速率均大于1.5℃/s;2个样品的示值误差分别为0.607×10^(4)、0.238×10^(4)copies/μL,线性相关系数为-0.998。结果表明,本次校准的实时荧光定量PCR仪只在较低设定温度下,温度的准确性和均匀度较差,但是样品的回归直线拟合度高、线性相关性强,能够满足检测和科研需要。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr仪 校准 温度 标准物质
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR方法的建立及在病原筛查中的应用
5
作者 候凤 张慧敏 +7 位作者 师小潇 王鹏江 高扬毅 李佳 武天增 李媛 韩瑞锴 贺笋 《中国兽药杂志》 2025年第9期16-23,共8页
为开发快速、准确检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法,根据引物设计原则在16S rRNA基因高度保守区设计引物对和探针,通过系统优化建立了该方法,对其特异性、敏感... 为开发快速、准确检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法,根据引物设计原则在16S rRNA基因高度保守区设计引物对和探针,通过系统优化建立了该方法,对其特异性、敏感性和重复性进行了分析,并将该方法应用于50份临床样品检测。结果表明,该qPCR方法可以特异性地检测Mhp,对其他9种非靶标菌毒种无交叉反应;最低检测限为20 copies/μL;使用8个不同浓度的标准品进行5次重复性验证,Ct值的变异系数在1%以下;对临床采集的50份鼻拭子和咽拭子样品进行检测,咽拭子比鼻拭子的检出率和核酸含量高。本研究成功建立了Mhp的qPCR检测方法,可通过采集咽拭子样品检测Mhp病原核酸的方法应用于动物实验用猪筛选或临床感染情况筛查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 实时荧光定量pcr DNA标准品 鼻拭子 咽拭子
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生食动物性水产品中单增李斯特氏菌TaqMan实时荧光PCR检测法和国标法的比较研究 被引量：1
6
作者 刘爱芳 郑尔美 +2 位作者 王涵铮 毛展华 朱伟志 《食品安全导刊》 2025年第14期75-83,共9页
目的:针对生食动物性水产品中单增李斯特氏菌的检测需求,系统比较TaqMan实时荧光PCR与国家标准检测法的技术特性,以优化检测流程并提升食源性致病菌监控效率。方法:通过特异性实验筛选TaqMan检测体系的最佳引物探针组合,验证其灵敏度与... 目的:针对生食动物性水产品中单增李斯特氏菌的检测需求,系统比较TaqMan实时荧光PCR与国家标准检测法的技术特性,以优化检测流程并提升食源性致病菌监控效率。方法:通过特异性实验筛选TaqMan检测体系的最佳引物探针组合,验证其灵敏度与检测稳定性;对5类市售生食水产品(泥螺、即食海蜇丝、呛蟹、北极虾、三文鱼)进行检测,评估两种方法的检测效能差异。结果:筛选获得LIS2最优引物探针组合,其检测灵敏度达6×10^(2) CFU·mL^(-1);20 d稳定性实验显示6×10^(3) CFU·mL^(-1)菌悬液的Ct值变异系数为1.89%,稳定性良好。在对20份市售样品的检测中,两种方法阳性检出率完全一致。TaqMan法单样检测耗时较国标法缩短至50 h,但需依赖核酸扩增设备。结论:TaqMan实时荧光PCR适用于大批量样本初筛,建议与噬菌体裂解技术联用实现活菌检测;国标法作为确认方法对阳性样本进行复核评估,可以确保检测合规。研究证实建立“分子初筛-培养确认”的联合检测体系可提升检测效率,为食品微生物快检技术标准化及生食水产品安全监管提供数据支撑。 展开更多
关键词 单增李斯特氏菌 TaqMan实时荧光pcr 生食动物性水产品 国标法
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PCR技术在乳制品细菌检测中的应用研究
7
作者 张翼飞 丁博 《食品安全导刊》 2025年第25期153-155,共3页
本文聚焦聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)在乳制品细菌检测中的应用,简要概括其在致病菌、腐败菌、发酵菌等不同菌群检测中的应用,同时提出技术创新、标准化建设、人才培养及多技术联用等促进PCR技术在乳制品细菌检测中... 本文聚焦聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)在乳制品细菌检测中的应用,简要概括其在致病菌、腐败菌、发酵菌等不同菌群检测中的应用,同时提出技术创新、标准化建设、人才培养及多技术联用等促进PCR技术在乳制品细菌检测中应用的建议,以期为乳制品质量安全控制提供技术支持。 展开更多
关键词 聚合酶链式反应(pcr) 乳制品 细菌检测 检测标准 技术联用
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水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建 被引量：15
8
作者 胡秀华 何苗 +2 位作者 刘丽 李丹 施汉昌 《环境科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第2期380-385,共6页
采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进... 采用细胞培养和T-A克隆技术,在轮状病毒主要结构蛋白VP7基因序列上设计合成引物,经PCR扩增后将特异性产物连接入pGEM-T-easy载体中,经过酶切鉴定和测序分析获得轮状病毒cDNA标准品.利用常规PCR和实时定量PCR方法对所获得的cDNA标准品进行特异性、稳定性和重复性指标的检验.结果表明,利用此标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系（斜率为-3.353,R^2=0.995）;实时定量PCR熔解曲线分析表明,温度在81℃±0.5℃的PCR产物是轮状病毒VP7序列上的特异性产物,表明此标准品是轮状病毒特异性的;同时,所制备的标准品在实时定量PCR检测中具有较大的线性范围（9×10^0～9×10^11copies/μL,每个反应最低可以检测到9个拷贝数的轮状病毒cDNA,表明利用该标准品进行实时定量PCR分析时具有较高的检测灵敏性;此外,该标准品具有较高的稳定性和重复性（3次独立实验CV值在0.2%～0.9%之间）,可长期稳定保存.构建的标准品可用作检测水环境中轮状病毒的实时荧光定量PCR的外标准品. 展开更多
关键词 轮状病毒 克隆 标准品 实时荧光定量pcr
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免疫磁珠捕获联合PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法学研究 被引量：5
9
作者 王震 龚玉华 +4 位作者 钱彩娣 孙春红 周丽萍 傅行礼 邵启祥 《国际检验医学杂志》 CAS 2014年第21期2931-2933,共3页
目的采用免疫磁珠捕获（IMC）联合双内标PCR-ELISA（IMC-PCR-ELISA）技术,建立定量检测结核分枝杆菌的方法。方法制备能够特异性捕获结核分枝杆菌的免疫磁珠（Dynabeads）。并根据结核分枝杆菌Mtp40基因序列以及结核分枝杆菌复合体群I... 目的采用免疫磁珠捕获（IMC）联合双内标PCR-ELISA（IMC-PCR-ELISA）技术,建立定量检测结核分枝杆菌的方法。方法制备能够特异性捕获结核分枝杆菌的免疫磁珠（Dynabeads）。并根据结核分枝杆菌Mtp40基因序列以及结核分枝杆菌复合体群IS6110序列,设计2对特异性引物（上游引物的5′端用生物素修饰）,以及2条与PCR扩增片段等长的内参照片段（其与扩增模板在引物区的序列相同）和3套捕获探针（3′端用地高辛标记）。先通过免疫磁珠特异性捕获结核分枝杆菌,再联合双内标PCR-ELISA技术检测结核杆菌。结果采用IMC-PCR-ELISA技术定量检测结核分枝杆菌,全过程约4h,检测限为5×10^3 copies/mL,当低内标模板浓度在30-70copies/mL,高内标模板浓度在8 000-12 000copies/mL时,计算出的浓度与实际加入的目的模板浓度之间有良好的线性关系（r^2=0.998）,未发现非特异性反应。结论成功建立了IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法,此方法具有快速、灵敏、特异、可定量的特点。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 免疫磁珠捕获 双内标 pcr-ELISA
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猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立 被引量：20
10
作者 李明凤 魏战勇 +3 位作者 王学斌 张红英 王亚宾 崔保安 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期220-224,共5页
利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEMT载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法。... 利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEMT载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测。 展开更多
关键词 猪细小病毒 实时定量pcr 标准曲线
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实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌 被引量：12
11
作者 戴陈伟 童琳 +4 位作者 武昌俊 许勇 李舜 朱倩云 蔡标 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第23期8037-8041,共5页
目的建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段,将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,验证所得到的重组质粒,以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260... 目的建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段,将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,验证所得到的重组质粒,以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260,并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品;进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99),实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线,鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100CFU/m L。结论本方法便捷、高效、可靠,可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。 展开更多
关键词 志贺氏菌 实时荧光定量pcr 标准曲线 特异性 灵敏性
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实时荧光定量PCR标准品的制备及应用 被引量：37
12
作者 罗勇军 刘昕 《重庆医学》 CAS CSCD 2005年第3期414-415,共2页
目的　探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法。方法　通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量。结果　获得了预期希望的质粒。结论　该方法能大量制备质粒... 目的　探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法。方法　通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量。结果　获得了预期希望的质粒。结论　该方法能大量制备质粒标准品,在实验中取得较满意的效果。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 标准品 TAQMAN探针
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羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：5
13
作者 李超 赵魁 +6 位作者 赵权 贺文琦 宋德光 李晶 解胜男 陈克研 高丰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期270-273,共4页
针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达... 针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。 展开更多
关键词 羊传染性脓疱病毒 SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应 标准曲线
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PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立 被引量：23
14
作者 李慧锋 李丽 +2 位作者 张丽娟 徐玉良 李武峰 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 2010年第4期332-335,共4页
为研究PepT1 mRNA在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线。根据GenBank中PepT1的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物... 为研究PepT1 mRNA在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线。根据GenBank中PepT1的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物,其长度包含于引物一中,用荧光定量PCR来检测基因的表达。通过克隆出PepT1基因282 bp部分片段并插入到PMD18载体中,从而构建出绝对荧光定量PCR标准曲线。从实验结果得出标准曲线的回归方程为Y=-3.205X+34.170,其回归系数R2=0.990,溶解曲线表现为单一的峰,通过对结果的具体分析,认为该方法可靠,特异性均较强,可成功构建目的基因的标准曲线。 展开更多
关键词 鸡小肠 PepT1 荧光定量pcr 标准曲线
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基于PCR技术快速制备DNA Marker的研究 被引量：1
15
作者 吕金浮 乔宁 +3 位作者 刘永光 薛其勤 裴华丽 刘晓明 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2014年第8期149-151,156,共4页
DNA Marker是一组分子量大小已知的DNA片段混合物,用于指示核酸电泳中未知样品的分子量大小。基于PCR方法,设计了不同的引物对,以质粒p32a-CP为模板,分别扩增出大小为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp的DNA片段,初次制备出DNA Mark... DNA Marker是一组分子量大小已知的DNA片段混合物,用于指示核酸电泳中未知样品的分子量大小。基于PCR方法,设计了不同的引物对,以质粒p32a-CP为模板,分别扩增出大小为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp的DNA片段,初次制备出DNA Marker,并参照商品化的DM2000按一定的比例混合各片段进行优化。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,所制备的DNA Marker(命名为DL2000)质量稳定、条带清晰、分布均匀,在分子生物学试验中可用于标记DNA大小。 展开更多
关键词 DNA标准 pcr扩增 核酸电泳
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猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：11
16
作者 董玲娟 张彦明 +3 位作者 何雷 程敏 刘伟 林鸷 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2012年第2期13-19,共7页
【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对... 【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 荧光定量RT-pcr 质粒标准品
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牛病毒性腹泻/黏膜病病毒荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：6
17
作者 张康 郭志廷 +7 位作者 仇正英 张景艳 王磊 张凯 王贵波 梁芬芬 马倩 李建喜 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1042-1047,共6页
【目的】设计一种能够快速检测出牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)的方法。【方法】依据GenBank公布的BVDV 5′UTR基因属于特异性保守区域的前提,构建具有特异性的探针和引物,以体外转录病毒RNA作为绝对定量标准品... 【目的】设计一种能够快速检测出牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)的方法。【方法】依据GenBank公布的BVDV 5′UTR基因属于特异性保守区域的前提,构建具有特异性的探针和引物,以体外转录病毒RNA作为绝对定量标准品。对荧光定量RT-PCR方法的各反应条件进行优化,创建BVDV荧光定量PCR检测方法。【结果】5.026 7 copies·μL^(-1)是此检测方法的最低下限值,该方法拥有良好的重复性,变异系数在组内、组间均<1%。特异性较高,对其他病毒核酸的扩增均为阴性,如猪瘟病毒、口蹄疫病毒等。【结论】建立的BVDV荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为牛病毒性腹泻的早期诊断提供了重要的技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 5′UTR 实时荧光定量pcr RNA标准品
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实时荧光定量PCR检测猪细小病毒 被引量：6
18
作者 李小康 崔保安 +4 位作者 陈红英 魏战勇 郑兰兰 赵丽 吕晓丽 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1118-1121,共4页
根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的... 根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆。将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝。本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪细小病毒 实时荧光定量pcr 标准曲线
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鸡内参基因β-actin和GAPDH实时定量PCR重组质粒标准品的构建 被引量：7
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作者 陈欣虹 钱琨 +2 位作者 郁川 田野 秦爱建 《中国家禽》 北大核心 2011年第10期21-24,共4页
本研究从SPF鸡皮肤中提取总RNA,并反转录为cDNA;以该cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出看家基因β-actin和GAPDH,将PCR产物连入pGEM-Teasy载体,转化DH5α菌,经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定和DNA含量测定,得到定量的β-actin和G... 本研究从SPF鸡皮肤中提取总RNA,并反转录为cDNA;以该cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出看家基因β-actin和GAPDH,将PCR产物连入pGEM-Teasy载体,转化DH5α菌,经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定和DNA含量测定,得到定量的β-actin和GAPDH基因融合的重组质粒(pGEMT-actin和pGEMT-GAPDH),即实时定量PCR内参标准品。构建成功的标准品经10倍梯度稀释,作为模板,获得扩增效率良好及可信度高的标准曲线。构建成功的标准品可大量制备,可用于鸡的靶基因定量PCR所需的内参标准品。 展开更多
关键词 内参基因 实时定量pcr 标准品 标准曲线
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实时荧光定量PCR技术综述 被引量：46
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作者 邓文星 张映 《生物技术通报》 CAS CSCD 2007年第5期93-95,103,共4页
实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。与传统PCR相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测。
关键词 实时荧光定量pcr 标准曲线
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